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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-61556
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2013/6155/


Die Invasion und Freisetzung prä-erythrozytärer Plasmodium-Parasiten erfordert eine geregelte Proteaseaktivität

Heitmann, Anna

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Malaria , Plasmodium berghei , Proteasen , Leberphase
Basisklassifikation: 42.36
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Heussler, Volker T. (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 22.03.2013
Erstellungsjahr: 2013
Publikationsdatum: 24.05.2013
Kurzfassung auf Deutsch: Cysteinproteasen spielen im Metabolismus aller Organismen eine wichtige Rolle. Besonders für Parasiten ist die Regulation der Proteaseaktivität von großer Bedeutung, da sie neben den endogenen Proteasen auch die Wirtsproteasen, die häufig zur Pathogenabwehr eingesetzt werden, regulieren müssen.
Der Malariaerreger Plasmodium berghei exprimiert in allen Lebensphasen den Cysteinproteaseinhibitor PbICP (P. berghei inhibitor of cysteinproteases), ein ungewöhnliches Mitglied der Chagasinfamilie. Im Rahmen dieser Arbeit wurde dieser Inhibitor und seine Bedeutung im Lebenszyklus von P. berghei untersucht. Hierbei konnte der N-terminalen Domäne, (PbICP-N) die nur von Plasmodium ICPs bekannt ist, eine Funktion für die Lokalisation des Proteins während der Leberphase zugeordnet werden. Bei der Untersuchung des Wirkungsspektrums der C-terminalen Inhibitordomäne (PbICP-C) konnte eine Inhibitoraktivität gegen Cathepsin L-ähnliche Proteasen gezeigt werden. Caspasen, Calpaine und Cathepsin B wurden dagegen nicht gehemmt, was in Strukturmodell-Analysen bestätigt werden konnte. Mit Hilfe eines PbICP-C-Knockout-Stammes konnte eine essentielle Funktion für PbICP in den Sporozoiten aufgedeckt werden. Vermutlich reguliert PbICP die Aktivität einer bisher unbekannten Cysteinprotease, die für die Prozessierung des multifunktionalen essentiellen Sporozoiten-Proteins CSP (circum sporozoite protein) verantwortlich ist.. Durch die Deletion von PbICP verlieren die Sporozoiten größtenteils ihre Fähigkeit in die Speicheldrüsen zu migrieren. Zudem scheinen sie in ihrer Motilität erheblich eingeschränkt zu sein. Auch in der Leberphase des Parasiten scheint PbICP eine wichtige Rolle zu übernehmen, während die Deletion von PbICP-C auf Parasiten der Blutphase keinen offensichtlich negativen Einfluss hatte.
Die erfolgreiche Entwicklung des Parasiten während der Leberphase ist von der Aktivität von Cysteinproteasen abhängig. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte die Cysteinproteaseaktivität am Ende der Leberphase untersucht werden. Mit synthetischen niedermolekularen Inhibitoren wurde die Aktivität von Cathepsin B- und Cathepsin C-ähnlichen Proteasen untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass eine Cathepsin B-ähnlichen Protease an der Formation von Tochtermerozoiten beteiligt zu sein scheint, die am Ende der Leberphase gebildeten Merosomen enthielten keine infektiösen Merozoiten mehr. Die Inhibition der Cathepsin C Parasiten-Protease PbDPAP3 (P. berghei dipeptidyl aminopeptidase) führte dazu, dass am Ende der Leberphase der größte Teil der Parasiten arretierte. Die Formation der Tochtermerozoiten verlief normal, die anschließende Auflösung der parasitophoren Vakuole war jedoch gestört, was die erfolgreiche Beendung der Leberphase blockierte.
Die in dieser Arbeit erworbenen Erkenntnisse decken möglicherweise bisher unbekannte parasitäre Proteasen als neue Zielproteine bei der Therapie von Malaria auf. Mit Hilfe der Struktur von PbICP könnten selektive Inhibitoren gegen diese Parasiten-Proteasen entwickelt werden. Dies würde eine Therapie ermöglichen, die schon vor den klinischen Symptomen eingreift, die durch die Parasiten der Blutphase ausgelöst werden.
Kurzfassung auf Englisch: The regulation of protease activity is important for all organisms, in particular for intracellular parasites. They have to control both their own proteases as well as the proteases of their host cell, which are often involved in the defense against parasites. Plasmodium berghei, the causative agent of rodent malaria, expresses a cysteine protease inhibitor (PbICP) as a potential regulator of the cysteine proteases. PbICP is an unusual member of the chagasin-like cysteine protease inhibitors, which are unique to protozoa. In context of my PhD Thesis I characterized the function of PbICP and the activity of cysteine proteases in the exoerythrocytic stage.
The chagasin-like C-terminal domain, PbICP-C, inhibits Cathepsin L-like proteases, but no Calpains, Caspases, Cathepsin B and potentially no Cathepsin C. The N-terminal domain is unique for Plasmodium ICPs and has a function in the export of the protein during liver stage. Studies with the PbICP-knockout-strain showed an essential function of PbICP for sporozoites and an important role during the liver stage, however the deletion of pbicp had no influence on the development of bloodstage parasites. PbICP-knockout-Sporozoites are restricted in their motility and they lose the ability to enter the salivary glands of mosquitoes. This is probably due to a regulatory function of PbICP for the processing of CSP (circum sporozoite protein), an essential multifunctional protein of sporozoites.
Furthermore I investigated the influence of cathepsin B- and cathepsin C-like proteases on parasite development during the late liver stage. In this regard I treated parasites in vitro with synthetic low molecular inhibitors. The inhibition of cathepsin B-like proteases lead to an abnormal phenotype. The nuclei of the daughter-parasites fused to a big vesicle, no formation of daughter merozoites could be observed and the parasites were not infectious anymore. Therefore, a cathepsin B-like protease is appears to be essential for the formation of merozoites. The inhibition of the parasite cathepsin C protease PbDPAP3 (P. berghei dipeptidyl aminopeptidase 3) at the end of the liver stage blocked parasite egress from the parasitophorous vacuole, which is the initiating step for the release of the parasites into the bloodstream.
The results of this study may uncover so far unknown proteases as new drug targets. Using the structure of PbICP, selective inhibitors of parasitic proteases could be generated.

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