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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-61627
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2013/6162/


Synthese und in vivo Charakterisierung von 59Fe-markierten, monodispersen, superparamagnetischen Eisenoxidnanopartikeln

Freund, Barbara

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SWD-Schlagwörter: Nanopartikel , In vivo , Metabolismus , Isotopenmarkierung
Freie Schlagwörter (Deutsch): SPIO
Basisklassifikation: 35.99
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Nielsen, Peter (PD Dr. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 11.05.2012
Erstellungsjahr: 2012
Publikationsdatum: 13.05.2013
Kurzfassung auf Deutsch: In dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, superparamagnetische Eisenoxidnanopartikel (SPIOs) postsynthetisch radioaktiv mit 59Fe zu markieren. Die Technik ist universell für SPIOs verschiedener Größe, die durch nasschemische organometallische Hochtemperatursynthesen hergestellt wurden, einsetzbar. Ferrit-Nanopartikel, die auf diesem Weg synthetisiert wurden, zeichnen sich durch eine enge Größenverteilung und hohe Kristallinität aus, die sie in ihren magnetischen Eigenschaften den kommerziell erwerbbaren polydispersen SPIOs überlegen machen. Die von uns entwickelte Markierungsmethode hat viele Vorteile. Da die Radioaktivität erst nach Fertigstellung der SPIOs in das Partikel bei Raumtemperatur eingeführt wird, kann das Risiko für den Experimentator auf Grund des einfachen Aufbaus minimiert werden. Des Weiteren können die Partikel vor der Markierung bereits vollständig charakterisiert und die Ansatzgröße auf beliebig kleine Größen herunterskaliert werden, was eine bedarfsgerechte Produktion von radioaktiven SPIOs ermöglicht.
Die Stabilität der radioaktiven Markierung wurde mit unterschiedlichen Methoden überprüft. Es konnte gezeigt werden, dass es nicht zu einem „Ausbluten“ der Markierung beim wiederholten Abtrennen von freiem Eisen durch Filterung oder Dialyse kam. Auch bei der Größenausschlusschromatographie zeigte sich eine strenge Co-Lokalisation der Radioaktivität und der SPIOs in allen Fraktionen. Der kontrollierte Verdau der SPIOs in Salzsäure zeigt, dass die Freisetzung von 59Fe und 56Fe einer ähnlichen Kinetik folgt. Im Transmissionselektronenmikroskop und im Magnetresonanztomographen konnte keine Veränderung der Größe, des Agglomerationsverhalten und der magnetischen Eigenschaften durch die radioaktive Markierung detektiert werden. Daraus lässt sich schließen, dass die von uns entwickelte Methode dazu geeignet ist, monodisperse SPIOs radioaktiv zu markieren. Die Stabilität des Labels erlaubt einen Einsatz dieser markierten Partikel in vivo, die dazu dient, wichtige pharmakokinetische Parameter, die die Voraussetzung für eine Medikamentenzulassung sind, zu ermitteln.
Die aus der Hochtemperatur gewonnenen SPIOs tragen auf ihrer Oberfläche Ölsäure, die sie vor Agglomeration schützt, sie aber auch lipophil macht. Vor einem Einsatz in vivo müssen die SPIOs deshalb wasserlöslich gemacht werden. In dieser Arbeit wurden als Oberflächenmodifikationen der Ligandenaustausch mit einer phosphorylierten Polyethylenglykolkette, das Verpacken in ein amphiphiles Polymer und die Verkapselung in rekombinante Lipoproteine verwendet.
Die so verpackten SPIOs wurden dazu verwendet, Unterschiede in pharmakokinetischen Parametern wie Bluthalbwertszeit und Bioverteilung, die durch unterschiedliche Applikation, Größe und Verpackung der Partikel zustande kommen, zu ermitteln. Durch die Verwendung von fluoreszierenden Quantumdots bei gleichem Hüllmaterial konnte ermittelt werden, in welche Zellen der Leber die Nanopartikel aufgenommen werden. Diese Erkenntnisse wurden in einem Mausmodell genutzt, um einen effektiven Schutz vor experimenteller Autoimmun-Encephalomyelitis (EAE) durch den Transport spezifischer T-Zellen-aktivierender Peptide in die Endothelzellen der Leber zu etablieren (Herkel et al., Patent Nr. 11009032.1-2112).
Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass in Abhängigkeit vom Zelltyp, der die SPIOs aufnimmt, auch die Metabolisierung und somit die Freisetzung des Eisens und die Inkorporation in neugebildete Erythrozyten unterschiedlich schnell und umfangreich verläuft. Durch eine transiente Depletion der Makrophagen mit clodronathaltigen Liposomen konnte gezeigt werden, dass die Kupffer Zellen eine zentrale Rolle im Abbau der SPIOs spielen, während die Endothelzellen in Lebersinusoiden nur bedingt zu einer Metabolisierung fähig sind. Mit Hilfe des Hamburger Biosuszeptometers konnte der Verlust des Superparamagnetismus beim Abbau der SPIOs erstmals in vivo am lebenden Tier verfolgt werden. Durch den Einsatz der radioaktiven Markierung war es möglich, diese Vorgänge zu quantifizieren und unter Verwendung eines [2+1]–Kompartment-Modells die Ratenkonstanten mit hoher Genauigkeit zu ermitteln.
In einer weiteren in vivo-Anwendung wurden die radioaktiv markierten SPIOs in rekombinante Chylomikronen eingebettet und damit Veränderungen im Lipoproteinstoffwechsel durch Kälteaktivierung des braunen Fettgewebes quantifiziert (Bartelt et al., Nature Medicine 2011, 17, 200).
Auf dem Weg hin zu spezifischen Kontrastmitteln wurde Transferrin an polymerumhüllte SPIOs gekoppelt. Nachdem die Stabilität der Kopplung gezeigt werden konnte, war es möglich mit Hilfe von 59Fe die Funktionalität des Transferrins nach der Kopplung zu überprüfen und gleichzeitig die Hülle der SPIOs radioaktiv zu markieren.
Im Rahmen dieser Arbeit ist es somit gelungen, monodisperse SPIOs radioaktiv zu markieren und sie in vivo zu charakterisieren.
Kurzfassung auf Englisch: Within the scope of the present thesis a method to label superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIOs) radioactively with 59Fe in a postsynthetic manner was developed. It is an all-purpose approach that can be applied to all sizes of SPIOs which have been obtained by an organometallic high temperature synthesis. This kind of ferrite nanoparticles is characterized by a small size distribution and a high crystallinity which makes their magnetic properties superior to commercially available polydisperse SPIOs. This labeling method has some advantages. As radioactivity is introduced at room temperature after the particle has been synthesized, the risk for the experimenter can be reduced to a minimum because of the easy setup. Furthermore, the SPIOs can be characterized completely before the labeling and the quantity can be downscaled in a user-defined manner, making an on-demand production of radioactively labeled SPIOs possible.
Different aspects of the stability of the label were verified. It was shown that the label is not “washed out” of the nanoparticles when free iron is removed repeatedly by centrifugation units or dialysis. Additionally, the size-exclusion-chromatography shows a strict co-localization of radioactivity and SPIOs in all fractions. The controlled digestion of the SPIOs in hydrochloric acid suggests that the release of 56Fe and 59Fe follows similar kinetics. No differences in size and agglomeration behavior could be detected in the transmission electron microscope or in magnetic resonance imaging. This leads to the conclusion that the developed method can be used to radioactively label monodisperse SPIOs. The stability of the label allows an application in vivo to obtain important pharmacokinetic parameters which are a requirement for the administration of new pharmaceuticals.
The surface of SPIOs that have been synthesized by a high temperature method is covered in oleic acid which protects them from agglomeration while rendering them lipophilic. Therefore, the surface has to be altered to make the SPIOs water-soluble, before they can be applied in vivo. In the present thesis a ligand exchange against a phosphorylated polyethylene glycol chain, an encapsulation with an amphiphilic polymer and the embedding into the core of recombinant lipoproteins were employed as surface modifications.
These SPIOs were used to identify differences in blood half-life and biodistribution caused by different modes of application or size and surface modifications of the particle. By using fluorescent quantum dots it was possible to determine which cells in the liver take up the nanoparticles. These findings were used in a mouse model to establish an effective protection against experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) by transporting a T-cell-activating peptide into endothelial cells of the liver (Herkel et al., Patent Nr. 11009032.1-2112).
Furthermore, it could be shown that the metabolism of the SPIOs depends on the cell type that absorbs the nanoparticle and therefore the release of iron and the incorporation into newly formed erythrocytes proceeds at a different speed and to a different extent. Through transient depletion of the macrophages with clodronate-containing liposomes it could be verified that Kupffer cells play a central role in the processing while the sinus-lining endothelial cells are limited in their ability to metabolize SPIOs. The Hamburger Biosuszeptometer was used to monitor the loss of the superparamagnetism through metabolism in vivo in a living animal for the first time. Through the use of the radioactive label it was possible to quantify these processes and to calculate the rate constants through a [2+1]-compartment-model with high precision.
In addition the radioactively labeled SPIOs embedded in recombinant chylomicrones were used to quantify changes in lipoprotein pathways after cold activation of the brown adipose tissue (Bartelt et al., Nature Medicine 2011, 17, 200).
On the way to specific contrast agents, transferrin was coupled to polymer-coated SPIOs. The stability of the label was ascertained. Through the use of 59Fe it was possible to verify the functionality of the transferrin after the coupling and at the same time to radioactively label the shell of the SPIOs.
In conclusion a method to radioactively label monodisperse SPIOs was established and used to characterise these SPIOs in vivo.

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