FAQ
© 2015 Staats- und Universitätsbibliothek
Hamburg, Carl von Ossietzky

Öffnungszeiten heute09.00 bis 24.00 Uhr alle Öffnungszeiten

Eingang zum Volltext in OPUS

Hinweis zum Urheberrecht

Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-61702
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2013/6170/


Analysis of activity-induced changes in the subcellular distribution of the postsynaptic scaffold protein gephyrin in cultured hippocampal neurons from Mus musculus (Linnaeus, 1784)

Analyse aktivitätsabhängiger Veränderungen in der subzellulären Verteilung des postsynaptischen Gerüstproteins Gephyrin in kultivierten Neuronen von Mus musculus (Linnaeus, 1784)

Rathgeber, Louisa

pdf-Format:
 Dokument 1.pdf (23.291 KB) 


Basisklassifikation: 42.13 , 42.15
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Kneussel, Matthias (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 05.04.2013
Erstellungsjahr: 2013
Publikationsdatum: 15.05.2013
Kurzfassung auf Englisch: Directed intracellular transport in neuronal cells is essential for the establishment and maintenance of neuronal morphology and polarity. Most proteins are synthesized within the cell soma and subsequently transported into the somato-dendritic or the axonal compartment towards their final destination. Two processes are involved in the distribution of newly-synthesized proteins: sorting and transport.
Protein sorting determines the composition of individual transport vesicles and establishes the seperation of transport complexes designated for either the somato-dendritic or the axonal compartment. Protein transport is the processes following sorting and involves the active movement of motor proteins and their cargoes along cytoskeletal tracks. The long-distance intracellular transport along microtubules from the soma to the periphery can be regulated by several mechanisms. For instance, motor-cargo-adaptors are capable of influencing motor proteins by regulating their processivity or by directing them towards a specific cellular compartment. Also, the molecular tracks underlying intracellular transport can contribute to its regulation. Several posttranslational modifications of α- and β-tubulin can influence motor protein affinity and processivity or provide directional cues.

In this study, mechanisms underlying the targeted distribution of fluorescently-labelled gephyrin (tomato-gephyrin) in cultured hippocampal neurons were investigated. Gephyrin is part of the postsynaptic scaffold at inhibitory synapses, anchoring GABAA and glycine receptors within the postsynaptic membrane. It is furthermore involved in the transport of glycine receptors to and from the synapse by mediating the binding to the molecular motors KIF5 and cytoplasmic dynein, respectively. In the current study, it was investigated how the subcellular distribution of tomato-gephyrin is altered upon activation of the AMPA-type of ionotropic glutamate receptors. A previous study had revealed that gephyrin targeting is changed upon strychnine-induced glycine receptor blockade due to an increase of tubulin polyglutamylation, a posttranslational modification of the microtubular cytoskeleton. In line with these results, it could be shown in this study that the number of tomato-gephyrin clusters within the neurites of cultured hippocampal neurons was significantly reduced upon AMPA receptor activation when compared to control neurons. Furthermore, it was discovered that two types of tubulin posttranslational modifications were significantly changed in AMPA-treated neurons when compared to controls. Polyglutamylation of tubulin, a modification that involves the attachment of several glutamyl residues to the C-termini of α- and β-tubulin, was strongly increased upon AMPA receptor activation, while tubulin tyrosination, i.e. the re-attachment of a previously removed tyrosine residue to the C-terminus of α- and β-tubulin, was decreased compared to controls. It could also be shown that AMPA receptor activation caused a significant increase of intracellular calcium concentrations and led to the activation of calcium/Calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII). Further experiments investigated the role of several signaling cascades following AMPA receptor activation and it could be shown that inhibition of glycogen synthase kinase 3β (GSK3β), which is known to phosphorylate gephyrin, influences the targeting of tomato-gephyrin to the cell periphery in a similar manner as AMPA receptor stimulation.
A second part of this study dealt with the identification and description of additional effects of AMPA receptor activation on the clustering and distribution of tomato-gephyrin. It was observed that tomato-gephyrin clusters are increasingly distributed into the axon of hippocampal neurons upon AMPA receptor activation. A redistribution into the axonal compartment could moreover be shown for further components of inhibitory synapses, such as glycine receptors and the cell adhesion molecule neuroligin-2, while PSD95, a part of excitatory synapses, was not redistributed into the axon.

Summarizing, this study shed light on the mechanisms involved in the regulation of intracellular protein transport after activation of neurotransmitter receptors by identifying specific changes in posttranslational modifications of tubulin and a possible role of adaptor protein phosphorylation. Furthermore, this study revealed a redistribution of inhibitory synapse components into the axons of hippocampal neurons as a result of AMPA receptor activation. Future investigations will be necessary to confirm the specific roles of tubulin modifications and gephyrin-phosphorylation by GSK3β as critical regulators of gephyrin targeting. Also, the redistribution of inhibitory synapse constituents into the axon upon AMPA receptor activation needs to be investigated in more detail in order to determine the physiological reasons – possibly homeostatic regulation – for this effect.
Kurzfassung auf Deutsch: Gerichteter intrazellulärer Proteintransport in Neuronen bildet die Grundlage zur Entwicklung und Aufrechterhaltung neuronaler Morphologie und Polarität. Die meisten Proteine werden im Zellsoma synthetisiert und anschließend in das somato-dendritische oder das axonal Kompartiment transportiert. Der Verteilung neusynthetisierter Proteine liegen dabei zwei Prozesse zu Grunde: Proteinsortierung und Proteintransport. Während der Proteinsortierung wird die Zusammensetzung einzelner Transportvesikel bestimmt und eine Unterteilung der Transportkomplexe nach ihrem Bestimmungsort im somato-dendritischen oder axonalen Kompartiment vorgenommen. Der Sortierung folgt der Proteintransport, welcher die aktive Bewegung von Motorproteinen und ihren Transportgütern entlang des Zytoskeletts beinhaltet. Der Langstreckentransport auf Mikrotubuli kann durch mehrere Mechanismen reguliert werden. Beispielsweise können Adapterproteine, die Motoren mit Frachtgütern verbinden, Motorproteine beeinflussen, indem sie ihre Prozessivität regulieren oder in das richtige Kompartiment lenken. Dess Weiteren tragen auch die „Schienen“, auf denen der intrazelluläre Transport stattfindet, zu dessen Regulierung bei. So gibt es verschiedene posttranslationale Modifikationen von α- und β-Tubulin, welche die Affinität und Prozessivität von Motorproteinen beeinflussen und richtungsweisende Signale setzen können.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden Mechanismen untersucht, die die Verteilung von Fluoreszenz-markiertem Gephyrin (tomato-Gephyrin) in hippokampalen Neuronen regulieren. Gephyrin ist ein Teil des postsynaptischen Gerüsts an inhibitorischen Synapsen, wo es für die Verankerung von GABAA- und Glyzin-Rezeptoren in der postsynaptischen Membran verantwortlich ist. Es ist außerdem am Transport des Glyzin-Rezeptors beteiligt, da es die Bindung der Motoren KIF5 und Dynein zum Rezeptor vermittelt. In dieser Arbeit wurde erforscht, wie sich die subzelluläre Verteilung von Gephyrin in Folge einer Aktivierung von ionotropen AMPA Rezeptoren verändert. Eine vorangehende Arbeit hatte zeigen können, dass die Verteilung von Gephyrin nach Strychnin-induzierter Glyzin-Rezeptor Blockade aufgrund vermehrter Tubulin-Polyglutamlylierung – einer posttranslationalen Modifikation des Zytoskeletts – verändert war. Diesen Ergebnissen von Maas et al. (2009) entsprechend konnte in der jetzigen Arbeit gezeigt werden, dass sich die Zahl der tomato-Gephyrin Aggregate in den Neuriten von kultivierten hippokampalen Neuronen signifikant reduziert, nachdem AMPA-Rezeptoren aktiviert wurden. Des Weiteren wurde eine Veränderung von zwei Arten von posttranslationalen Modifikationen an Tubulin nach AMPA-Rezeptor-Aktivierung entdeckt. Polyglutamylierung, eine Veränderung die das Anfügungen von Glutamylresten an die C-Termini von α- und β-Tubulin beeinhaltet, war nach AMPA-Rezeptor-Aktivierung im Vergleich zu Kontrollen signifikant erhöht. Tubulin Tyrosinierung hingegen, also das Anfügungen eines zuvor entfernten Tyrosinrestes an die C-Termini von α- und β-Tubulin, war im Vergleich zu Kontrollen signifikant reduziert. Diese Veränderungen weisen auf eine entscheidende Funktion der Tubulin Modifikationen in der Regulation von intrazellulären Transportprozessen hin. Es konnte zusätzlich gezeigt werden, dass die Aktivierung von AMPA-Rezeptoren für einen signifikanten Anstieg der intrazellulären Kalzium-Konzentration und für eine Aktivierung der Calcium/Calmodulin abhängigen Protein Kinase II (CaMKII) sorgt. Nachfolgende Experimente untersuchten die Rolle verschiedener intrazellulärer Signalkaskaden nach AMPA-Rezeptor-Aktivierung. Hierbei gezeigt werden, dass die Inhibierung der Glykogen Synthase Kinase 3β (GSK3β) – welche Gephyrin phosphoryliert – die Verteilung von tomato-Gephyrin in die Zellperipherie in ähnlicher Weise beeinflusst wie die AMPA-Rezeptor-Aktivierung.
Ein zweiter Teil dieser Arbeit befasste sich mit der Identifizierung und Charakterisierung weiterer Folgen von AMPA-Rezeptor-Aktivierung in Bezug auf die Aggregat-Bildung und Verteilung von tomato-Gephyrin. Es wurde beobachtet, dass eine vermehrte Umverteilung von tomato-Gephyrin ins Axon als Folge von AMPA-Rezeptor-Aktivierung auftritt. Eine Umverteilung ins Axon konnte ferner für weitere Komponenten inhibitorischer Synapsen, wie Glyzin-Rezeptoren und das Zelladhesionsmolekül Neuroligin-2 gezeigt werden, während PSD95, welches an exzitatorischen Synapsen vorkommt, nicht umverteilt wurde.
Zusammenfassend konnte diese Arbeit einen Beitrag zur Aufklärung von Mechanismen leisten, die den intrazellulären Proteintransport nach Aktivierung von Neurotransmitter-Rezeptoren regulieren, indem spezifische posttranslationale Tubulin-Modifikationen und eine mögliche Rolle von Adaptorprotein-Phosphorylierung identifiziert werden konnten. Außerdem wurde eine Umverteilung von Komponenten der inhibitorischen Synapse in Axone kultivierter hippokampaler Neurone als Folge von AMPA-Rezeptor-Aktivierung entdeckt. Weiterführende Arbeiten sind notwendig, um die Rolle von Tubulin-Modifikationen und der GSK3β-vermittelten Phosphorylierung von Gephyrin als Regulatoren des Transportes zu untermauern. Zudem sind weitere Experimente erforderlich, um die Umverteilung inhibitorischer synaptischer Komponenten ins Axon genauer zu beschreiben und physiologische Gründe – wie zum Beispiel homöostatische Regulation – dafür zu bestimmen.

Zugriffsstatistik

keine Statistikdaten vorhanden
Legende