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Hamburg, Carl von Ossietzky

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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-61795
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2013/6179/


Functional roles of transient receptor potential canonical channels and myristoylated alanine-rich protein kinase C substrate as novel interaction partners of the neural cell adhesion molecule NCAM and polysialic acid in Mus musculus (Linnaeus, 1758)

Funktionelle Rollen der transienten Rezeptorpotential canonical Kanäle und dem myristoylierten Alanin-reichen Proteinkinase C Substrat als neue Interaktionpartner des neuralen Zelladhäsionsmoleküls NCAM und der Polysialinsäure in Mus musculus (Linnaeus, 1758)

Theis, Thomas

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SWD-Schlagwörter: Neurales Zell-Adhäsionsmolekül , Proteinkinase C , Plasmamembran
Freie Schlagwörter (Deutsch): Polysialinsäure, MARCKS, Interaktion, Neuritenwachstum
Freie Schlagwörter (Englisch): polysialic acid , neurite outgrowth , interaction
Basisklassifikation: 42.13 , 42.15
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Schachner, Melitta (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 17.05.2013
Erstellungsjahr: 2013
Publikationsdatum: 23.05.2013
Kurzfassung auf Englisch: The neural cell adhesion molecule (NCAM) is a member of the immunoglobulin superfamily which plays important roles in fundamental events during development of the nervous system such as neuritogenesis, synaptic plasticity and long-term potentiation. In the nervous system three major NCAM isoforms are expressed: NCAM120, NCAM140 and NCAM180. NCAM120 is attached to the cell membrane via a glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchor, whereas NCAM140 and NCAM180 are single pass transmembrane proteins. NCAM140 differs from NCAM180 by an additional sequence stretch in the intracellular domain (ICD). All NCAM isoforms are glycosylated and carry the functionally important human natural killer cell glycan (HNK-1) and polysialic acid (PSA). Numerous intra- and extracellular binding partners of NCAM have been identified, among them are the fibroblast growth factor receptor (FGFR), the tyrosine kinase TrkB and the inwardly-rectifying potassium channel Kir3.3. The aim of my thesis was to identify novel direct interaction partners of NCAM and PSA and to investigate their functional roles in the nervous system.
I could identify the transient receptor potential canonical channel (TRPC) 1, 4 and 5 as novel intracellular interaction partners of NCAM140 and NCAM180. Furthermore, a direct calmodulin-dependent binding of the N-termini of these TRPCs to the ICD of NCAM180, but not to the ICD of NCAM140 could be shown by a label free binding assay. Cell surface biotinylation and immunostainings of cultured murine hippocampal neurons confirmed that TRPC4 and 5 were present at the cell surface and that they co-localized with NCAM, respectively. NCAM-mediated neurite outgrowth of hippocampal neurons was blocked with the TRPC channel inhibitor SKF96365 and a function-blocking antibody against TRPC1. Calcium imaging revealed that stimulation of hippocampal neurons with an antibody against NCAM led to opening of SKF96365-sensitive calcium channels in the plasma membrane, suggesting that TRPC channels mediate NCAM-induced calcium influx at the plasma membrane. The TRPC inhibitor SKF96365 also reduced the generation and nuclear import of a transmembrane 50 kDa NCAM fragment upon stimulation of cerebellar neurons with NCAM antibodies directed against the extracellular domain (ECD). Interestingly, increased levels of PSA and HNK-1 have been found in the nucleus after NCAM stimulation.
Numerus of binding partners of NCAM have been identified, whereas only a few binding partners for PSA have been identified. Here, I characterize the interaction between PSA and its novel binding partner myristoylated alanine-rich C-kinase substrate (MARCKS). MARCKS is an intracellular protein which can be inserted into the plasma membrane via its effector domain (ED). I could show that the interaction of PSA and MARCKS takes place in the plane of the plasma membrane. PSA inserts into the plasma membrane from the extracellular side of the membrane, while MARCKS inserts from the cytoplasmic side of the membrane. Co-localization of MARCKS and PSA at the plasma membrane of transfected CHO cells and cerebellar neurons could be demonstrated by immunostaining and fluorescence resonance energy transfer (FRET) analysis using fluorescence-labelled PSA. The distance between the green fluorescent protein (GFP) labelled MARCKS and fluorescently labelled PSA was 20-40 nm. Furthermore, when cells were transfected with a MARCKS-GFP mutant containing five alanine residues in the ED instead of five phenylalanine residues a drastically reduced FRET signal was observed indicating that mutation of the ED disrupts the interaction between MARCKS and PSA within the membrane. Treatment or transfection of hippocampal neurons with a peptide containing the ED of MARCKS blocked PSA-triggered neurite outgrowth of wild-type and NCAM-deficient mice. Capacitance measurements using artificial lipid bilayers provide supportive evidence that PSA interacts with the ED of MARCKS from opposite sides of the membrane. In addition, the interaction between PSA and MARCKS leads to changes in the electrical properties of the artificial membrane, suggesting that PSA-MARCKS interactions can modulate electrical properties of neuronal membranes.
Kurzfassung auf Deutsch: NCAM (neural cell adhesion molecule) ist ein Zelladhäsionsmolekül der Immunoglobulin-Superfamilie, welches eine wichtige Rolle in der Entwicklung und der Plastizität des Nervensystems spielt. Im Nervensystem werden überwiegend die drei Isoformen NCAM120, NCAM140 und NCAM180 exprimiert. NCAM120 ist mit einem Glykosylphosphatidylinositol (GPI)-Anker mit der Zellmembran verbunden. NCAM140 und NCAM180 enthalten eine transmembrane und eine intrazelluläre Domäne. Die intrazelluläre Domäne von NCAM180 enthält einen zusätzlichen Sequenzabschnitt. NCAM ist glykolisiert und kann das HNK-1 (human natural killer cell) Glykan und/oder PSA (polysialic acid) tragen. Eine wachsende Anzahl von intra- und extrazellulären Bindungspartnern von NCAM, wie der Fibroblasten-Wachstumsfaktorrezeptor, die Tyrosinkinase TrkB und der einwärts gerichtete Kaliumkanal Kir3.3, wurden identifiziert, wohingegen nur wenige Rezeptoren für PSA bekannt sind. Das Ziel meiner Arbeit war neue Interaktionspartner von NCAM und PSA zu identifizieren und deren funktionelle Rolle im Nervensystem zu untersuchen.
In der vorliegenden Arbeit konnte ich TRPC (transient receptor potential canonical)-1, -4 und -5 als neue Interaktionspartner von NCAM identifizieren. Immunfärbungen und Oberflächenbiotinylierung von hippokampalen Neuronen zeigten dass TRPC4/5 mit NCAM kolokalisiert und an der Oberfläche lokalisiert ist. Mit einer markierungsfreien Bindungsstudie wurde eine Calmodulin-abhängige Interaktion zwischen dem N-Terminus von TRPC1, -4 und -5 und der intrazellulären Domäne von NCAM180 nachgewiesen. Um die funktionellen Konsequenzen der TRPC-NCAM Interaktion zu untersuchen, wurden Neuritenwachstumsexperimente mit primären hippokampalen Neuronen durchgeführt. NCAM-vermitteltes Neuritenwachstum konnte durch den TRPC Kanal Inhibitor SKF96365 und einen inhibitorischen Antikörper gegen TRPC1 blockiert werden. Calcium imaging Experimente zeigten ein Öffnen von SKF96365-sensitiven Kalziumkanälen in der Zellmembran nachdem die Neurone mit einem Antikörper gegen NCAM stimuliert wurden. Dies deutet darauf hin, dass TRPC Kanäle notwendig für den NCAM-induzierten Kalziumeinstrom sind. Darüber hinaus reduzierte der TRPC Inhibitor SKF96365 die Erzeugung und den nuklearen Import eines transmembranen 50 kDa NCAM Fragments nach der Stimulation von Körnerzellen aus dem Kleinhirn mit NCAM Antikörpern gegen die extrazelluläre Domäne. Interessanter Weise wurden die Gykane HNK-1 und PSA nach NCAM Stimulation vermehrt im Zellkern gefunden.
Eine Vielzahl an Bindungspartnern wurde für NCAM identifiziert, wohingegen für PSA nur wenige Bindungspartner bekannt sind. In der vorliegenden Arbeit habe ich die Interaktion zwischen PSA und MARCKS (myristoylated alanine-rich C-kinase substrate) charakterisiert. MARCKS ist ein intrazelluläres Protein, welches mit seiner ED (effector domain) in die Plasmamembran eindringen kann. Es konnte gezeigt werden, dass diese Interaktion in der Plasmamembran stattfindet. PSA dringt von der extrazellulären Seite und MARCKS von der cytoplasmatische Seite in die Membran ein.
Durch immunozytochemische und FRET (fluorescence resonanz energie transfer) Versuche mit transfizierten CHO Zellen und Körnerzellen aus dem Kleinhirn konnte eine Kolokalisation von PSA und MARCKS gezeigt werden. Die ermittelte Entfernung zwischen dem GFP (green fuorescent protein) markierten MARCKS und dem fluoreszenz-markierten PSA betrug 20 bis 40 nm. Darüber hinaus wurde eine drastische Reduzierung des FRET Signals beobachtet, wenn die Zellen mit einer MARCKS Mutante transfiziert wurden, in der die fünf Phenylalanine in der ED durch Alanine ausgetauscht wurden. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass die Mutation der ED die Interaktion zwischen MARCKS und PSA stört. Nach Behandlung oder Transfektion von hippokampalen Neuronen aus Wildtyp oder NCAM-defizienten Mäusen mit einem Peptid, welches die Aminosäuresequenz der ED von MARCKS enthält, wurde das PSA-induzierte Neuritenwachstum blockiert. Messungen der elektrischen Kapazität einer künstlichen Lipiddoppelschicht unterstützten die These, dass PSA mit der ED von MARCKS von unterschiedlichen Seiten der Membran interagieren. Zusätzlich wurden Änderungen in den elektrischen Eigenschaften der Membran bei der PSA-MARCKS Interaktion gezeigt, was die Vermutung nahe legt, dass die PSA-MARCKS Interaktion die elektrischen Eigenschaften von Neuronen moduliert.

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