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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-62051
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2013/6205/


"Development of Cell-based Therapeutic Approaches for the Treatment of Inherited Retinal Dystrophies" and "Experimental Myelination of the Lamina Cribrosa by Cell Transplantation"

"Entwicklung zellbasierter, therapeutischer Ansätze zur Behandlung von erblich bedingten Netzhautdystrophien" und "Experimentelle Myelinisierung der Lamina Cribrosa durch Zelltransplantation"

Jung, Gila Arlette

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SWD-Schlagwörter: Netzhaut , Netzhautkrankheit , Retinopathia pigmentosa
Freie Schlagwörter (Deutsch): neurale Stammzellen, neurotrophe Faktoren, Photorezeptoren, Zellersatztherapie, Myelinisierung
Freie Schlagwörter (Englisch): Retina dystrophy , neural stem cells , neurotrophic factors , photoreceptors, photoreceptor replacement, myelination
Basisklassifikation: 44.95 , 44.52 , 42.13 , 42.15
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Bartsch, Udo (Prof.Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 09.11.2012
Erstellungsjahr: 2013
Publikationsdatum: 14.06.2013
Kurzfassung auf Englisch: Impairment of vision constituted in inherited retinal degenerations is incurable and the major reason for the loss of visual acuity in industrialized countries until today. Genetic mutations lead to direct or through dysfunction mediated irreversible loss of the sensory cells of the retina, the photoreceptor cells. In the present thesis cell-based therapeutic approaches for progressive retinal dystrophies were addressed.
A cell-based replacement strategy that attempts to treat advanced retinal degenerations was addressed. The replacement of endogenous photoreceptor cells was employed in a transgenic mouse model of slowly progressing photoreceptor cell degeneration to investigate the influence of the dystrophic environment. Primary cell suspensions, containing high amounts of rod postmitotic precursors, were isolated from retinas of young postnatal EGFP-transgenic mice and subretinally transplanted into mice at the beginning and at advanced stage of degeneration. The impact of the pathology on engrafted donor cells was analysed. The transplanted cells integrated correctly with differentiation into fully mature photoreceptors at every post-transplantation interval analysed but with a significant decrease in quantities over time. The analysis showed a severe morphological alteration of the donor photoreceptors resembling the structure of the degenerate host retina. This suggests that the quantities of transplanted and integrated donor-derived cells are not sufficient to induce a beneficial impact on the degenerate retina.
For the early retinal degeneration neuroprotective strategies, that aim not to correct the gene defect but to treat its consequences, i.e. degeneration of photoreceptor cells and deterioration of visual function, offer the possibility of a therapy that is widely applicable across a range of conditions. For such approaches neurotrophic factors are promising candidates, if delivered continuously to the affected tissue. For the development of a stem-cell based intraocular delivery system for neurotrophic factors for preclinical investigations in mouse models, adherent cultivated neural stem cells have been genetically modified with a refined polycistronic lentiviral vector. The vector encoded for the neurotrophic factor ‘CNTF’, a reporter gene and a resistence gene. Pure genetically modified neural stem cells have been intravitreally transplanted into transgenic mouse models for progressive retinal degeneration. The intraocular and sustained delivery of ‘CNTF’ through the engineered neural stem cells resulted in highly significant preservation of photoreceptors compared to the control eye, which was treated with genetically modified cells lacking the expression of ‘CNTF’. Further, the cells evoked no adverse effects on the retinal structure and were trackable after analysis. All together these are arguments for the system to be applicable for the sustained delivery of therapeutical products in mouse models.
The method of intraocular neural stem-cell transplantation was used to address a basic neurobiological issue. The competence of the axonal segments of the retinal ganglion cells within the retina and the usually non-myelinated most retina proximal portion of the optic nerve to become myelinated was analysed. The proximal portion of the optic nerve inhibits the migration of oligodendrocyte progenitor cells from the optic nerve into the retina and the underlying mechanisms have to be further clarified. Retinal transplantations of oligodendrocyte progenitor cells to the optic disc demonstrated the competence of the retinal ganglion cell axonal segments within the lamina cribrosa to become myelinated and further confirmed the hypothesis that the prevented migration of oligodendrocyte progenitor cells into the proximal portion of the optic nerve and retina is controlled by non-neuronal factors located at the retinal end of the optic nerve to keep the retina free of myelin.
Kurzfassung auf Deutsch: Die Verminderung der Sehfähigkeit durch hereditäre Netzhautdystrophien ist nach wie vor unheilbar und der Hauptgrund für Erblindung in industrialisierten Staaten. Aufgrund genetischer Mutationen gehen die Sehnervenzellen der Netzhaut, die Photorezeptoren, direkt oder durch Dysfunktion irreversibel verloren. In der vorliegenden Arbeit wurden zellbasierte Therapieansätze für Netzhautdystrophien mit progredientem Verlauf beschrieben.
Für fortgeschrittene Netzhautdystrophien wird der Zellersatz degenerierender Photorezeptoren durch die Verpflanzung primärer, retinaler Zellsuspensionen diskutiert. Für diese zellbasierte Strategie wurde hier der Einfluss der dystrophen Umgebung eines transgenen Mausmodels, charakterisiert durch progredienten Photorezeptorzellverlust, auf verpflanzte Spenderphotorezeptoren beschrieben. Die Analyse auf Integration, Reifung und Überlebensdauer der mit ‚postmitotischen Stäbchenvorläuferzellen’ angereicherten Zellsuspension, aus neonatalen EGFP-Mäusen, nach Transplantation in die dystrophe Empfängernetzhaut zu verschiedenen Zeitpunkten, ergab, dass zu jedem analysierten Zeitpunkt ausgebildete Spenderphotorezeptoren zu finden waren. Jedoch nahm die Anzahl der integrierten Spenderphotorezeptoren mit der Länge des post-Transplantationsintervalls deutlich ab. Darüber hinaus konnte für die morphologische Beobachtung verzeichnet werden, dass die Spenderphotorezeptoren trotz Wildtyp-Charakters die Morphologie der endogenen, dystrophen Photorezeptoren annahmen.
Für frühe Stadien von Netzhautdystrophien wird die kontinuierliche, retinale Applikation von neuroprotektiven Faktoren diskutiert, da diese Strategie intendiert nicht den vorliegenden genetischen Defekt zu korrigieren, sondern die daraus folgenden Konsequenzen, wie die Degeneration der Photorezeptoren und die Verminderung der Sehfähigkeit, wird dieser Ansatz weitreichend einsetzbar. Hier wurde in einer Strategie der Einsatz von ‚zellulären Vektoren’ als retinales Vehikel für therapeutische Genprodukte für das Mausauge beschrieben. Dafür wurde ein stammzellbasiertes, intraokulares Transportsystem für neurotrophe Faktoren zur prä-klinischen Untersuchung im Mausmodell entwickelt, für das adherent kultivierte neurale Stammzellen als ‚zellulärere Vektoren’ für neurotrophe Faktoren verwendet wurden. Polycistronische lentivirale Vektoren wurden weiterentwickelt um genetisch modifizierte neurale Stammzellen hervorzubringen, die sich durch die Expression des sezernierten neurotrophen Faktors ‚CNTF’, eines fluoreszierenden Reporters sowie einer Antibiotikaresistenz auszeichnen. Neben Klon- und Differenzierungsanalysen konnte an zwei transgenen Mausmodellen für retinale Degeneration gezeigt werden, dass das etablierte System kontinuierlich ausreichend Faktor intraokular abgab, was durch den signifikanten Erhalt endogener Photorezeptoren belegt wurde. Eine weitere wichtige Beobachtung war die Abwesenheit einer morphologischen Beeinträchtigung der Empfängerretina, was das System einsetzbar macht für verschiedenste therapeutische Produkte in Mausmodellen.
Die Methodik der intraokularen neuralen Stammzelltransplantation wurde für die Untersuchung einer grundwissenschaftlichen Fragestellung herangezogen. Die Kompetenz der Myelinisierbarkeit axonaler Segmente der retinalen Ganglienzellen im retinanächsten Bereich des Sehnervs wurde analysiert. Dieser Bereich wirkt inhibitorisch auf die Migration oligodendrozytärer Vorläuferzellen vom Sehnerv in die Retina und der zugrunde liegende Mechanismus ist nicht gelöst. Über retinale Transplantation oligodendrozytärer Vorläuferzellen in den Blinden Fleck (Discus nervi optici), nahe der Lamina Cribrosa, wurden die axonalen Segmente retinaler Ganglienzellen in diesem Bereich myelinisiert, was die Hypothese einer Migrationshemmung oligodendrozytärer Vorläuferzellen vom Sehnerv in die Netzhaut durch ‚non-neuronal’ Faktoren am retinalen Ende des Sehnervs bekräftig.

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