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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-62260
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2013/6226/


Analyse der „Downstream“-Effekte von Vitamin B6 und deren Bedeutung für Plasmodium falciparum

Butzloff, Sabine

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SWD-Schlagwörter: Plasmodium falciparum , Malaria , Vitamin B6
Freie Schlagwörter (Deutsch): Aspartat Aminotransferase
Freie Schlagwörter (Englisch): aspartate aminotransferase
Basisklassifikation: 42.15
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Wrenger, Carsten (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 31.05.2013
Erstellungsjahr: 2013
Publikationsdatum: 21.06.2013
Kurzfassung auf Deutsch: Für Vitamin B6 konnte in Pilzen und Pflanzen eine antioxidative Wirkung, insbesondere gegen Singulett Sauerstoff (1O2) gezeigt werden. Diese Organismen besitzen, genau wie Plasmodium falciparum, eine de novo Synthese für die aktive Form von Vitamin B6, dem Pyridoxal-5-Phosphat (PLP). Um zu analysieren, ob und in welchem Maße Plasmodien während der erythrozytären Entwicklung 1O2 ausgesetzt sind, wurden mittels des Farbstoffes 3-(p-Aminophenyl) Fluoreszein (APF) und dem Photosensitizer Cercosporin, die 1O2-Konzentrationen in den einzelnen Stadien bestimmt. Während des Trophozoiten-Stadiums entsteht innerhalb der Parasiten am meisten 1O2 (0,3 nM), was durch die hohe metabolische Aktivität und dem damit verbundenen Hämoglobinabbau während dieser Phase erklärt werden kann. Die Studie stellt demnach eine neue Methode zur Quantifizierung von 1O2 innerhalb des Malariaparasiten P. falciparum dar und etabliert die Einteilung der Parasiten anhand ihrer Pixelanzahl in die erythrozytären Stadien. Gleichzeitig konnte 1O2 mittels Fluoreszenzmikroskopie in den verschiedenen Stadien visualisiert werden.
Der Zusammenhang zwischen PLP und 1O2 bei P. falciparum wurde durch Überexpression dominant-negativer Mutanten der PLP-Synthase in den Parasiten untersucht. Mittels Wachstumskurven konnte gezeigt werden, dass die Überexprimierer der inaktiven PLP-Synthase wesentlich sensitiver gegenüber Cercosporin-induziertem 1O2 waren. Außerdem wurde eine erhöhte 1O2-Konzentration im Vergleich zur Kontrollzelllinie gemessen. Andersrum war bei dem Überexprimierer des aktiven PLP-Synthase Komplexes ein geringerer 1O2-Gehalt zu detektieren. Demnach ist die de novo PLP-Synthese bei P. falciparum, während der Entwicklung im Erythrozyten, entscheidend für die Entgiftung von 1O2.
Außerdem wurde die eigentliche Funktion von PLP als Co-Faktor im Zusammenhang mit der PLP-abhängigen Aspartat Aminotransferase (AspAT) in P. falciparum analysiert. Es wurde eine doppelt mutierte AspAT generiert, welche inaktiv ist, die Wildtyp-AspAT jedoch binden und dadurch hemmen kann. Es konnte gezeigt werden, dass die Überexpression der dominant-negativen Mutante in Plasmodien im Vollmedium keinen Einfluss auf das Wachstum der Parasiten hat. Jedoch führte die Kultivierung der transgenen Parasiten in Aspartat-freiem Medium zu einem Wachstumsdefizit gegenüber der unbehandelten Zelllinie. Um diesen Effekt zu verstärken wurde der Einfluss der Malatdehydrogenase (MDH) untersucht. Dieses Enzym, welches mittels GFP-Fusionskonstrukt ebenfalls im Zytosol der Parasiten lokalisiert wurde, verwendet, genau wie die AspAT, Oxalacetat als Substrat. Inaktive MDH-Mutanten, welche die Wildtyp-MDH abfangen und inaktivieren, wurden generiert und zusammen mit der dominant-negativen AspAT in P. falciparum überexprimiert. Bei diesen Zelllinien zeigte sich schon im Vollmedium ein Wachstumsnachteil gegenüber der Kontrollzelllinie, welcher sich in Aspartat-freiem Medium noch stärker ausprägte. Aus diesen Ergebnissen lässt sich schließen, dass das im Wirts-Hämoglobin gebundene Aspartat für die Parasiten nicht ausreicht bzw. dem Parasiten nicht zur Verfügung steht. Jedoch zeigen die Ergebnisse, dass Plasmodien Aspartat aus dem Medium aufnehmen können. Im menschlichen Wirt steht den Parasiten jedoch wesentlich weniger Aspartat über das Blutplasma zur Verfügung, wodurch der hohe Bedarf an der Aminosäure für die Synthese der Pyrimidine sowie die Purin-Rückgewinnung wahrscheinlich nicht gedeckt werden kann. Dieser hohe Bedarf an Aspartat für die Plasmodien rückt die AspAT, als einziges Aspartat-produzierendes Enzym der Parasiten, in den Fokus neuer potenzieller Angriffspunkte. Außerdem verstärkt es die Wichtigkeit von PLP in den Parasiten, da die PLP-abhängige AspAT und die damit verbundene Aspartat-Produktion, welche entscheidend für das Überleben der Parasiten ist, die weitreichenden Auswirkungen einer inhibierten PLP-Synthese aufzeigen.
Kurzfassung auf Englisch: The antioxidative effect of Vitamin B6 against singlet oxygen (1O2) was already shown for plants and fungi. Like these organisms Plasmodium falciparum de novo synthesizes Pyridoxal-5-Phosphate (PLP), the active form of Vitamin B6. In order to detect the amount of 1O2 which is produced during the erythrocytic development of the parasite the dye 3-(p-aminophenyl) fluorescein (APF) and the photosensitizer cercosporin where used. During the trophozoite stage the parasite produces the highest amount of 1O2 suggesting that 1O2 derives predominantly from the digestion of hemoglobin. Thus, by means of this in vivo study a method which enables the measurement of 1O2 in P. falciparum was described for the first time and allowed the establishment of a new classification of the erythrocytic stages of the parasite by their number of pixels. In that way 1O2 was visualized by live cell fluorescence microscopy during the erythrocytic schizogony simultaneously.
The correlation of 1O2 and PLP in P. falciparum was analyzed by overexpressing dominant-negative mutants of the PLP synthase in transgenic parasites. Growth curves showed that the inactivation of the PLP synthase renders the parasites more susceptible against cercosporin-induced 1O2. Furthermore these parasites showed an increased 1O2 concentration compared to the mock control whereas less 1O2 was detected in the cell line overexpressing an active PLP synthase complex. Hence the de novo synthesis of PLP during the erythrocytic development of P. falciparum is possibly used to defang 1O2.
Furthermore, the main function of PLP as a cofactor was analyzed by studying the plasmodial PLP-dependent aspartate aminotransferase (AspAT). Therefore a dominant-negative mutant of the AspAT was generated which is inactive but still binds and thus inactivates the wild type enzyme. No growth effect was detectable due to the down regulated AspAT in these parasites in complete medium. However we observed a strong growth defect when the transgenic parasites were cultured in medium without aspartate. To enhance this effect the influence of the malate dehydrogenase (MDH) was analyzed. Oxaloacetate, the substrate of AspAT, is also the substrate of the MDH and like the AspAT this enzyme is also localized in the cytosol of the parasite as analyzed by GFP fusion construct. Inactive MDH mutants which are still able to catch and hence inactivate the wild type enzyme were generated and co-overexpressed together with the dominant-negative AspAT in a growth defect already in complete medium which intensified when cultured in medium without aspartate. These results reveal that host aspartate, mainly bound in the hemoglobin, is not sufficient or not available for the parasite. However the study showed that cultured parasites are able to take up aspartate from environment yet the human blood supplies much less aspartate than the complete medium. The physiological amounts are probably not high enough to cover the requirements of aspartate needed by P. falciparum for the de novo synthesis of pyrimidines and the salvage of purines. The urgency of aspartate production by the plasmodial AspAT focuses this enzyme as a new potential target against malaria. Furthermore, the importance of the de novo PLP synthesis is highlighted since the AspAT is PLP-dependent and thus injurious effects by inhibition of the plasmodial PLP synthase complex are expected.

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