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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-63098
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2013/6309/


Detektion und Charakterisierung von zirkulierenden Tumorzellen aus dem peripheren Blut von Patienten mit Glioblastoma multiforme und die Kultivierung von Tumorzellen

Müller, Carolin

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SWD-Schlagwörter: Glioblastom , Metastase , Einzelzellanalyse , Knochenmark
Freie Schlagwörter (Deutsch): zirkulierende Tumorzellen , disseminierte Tumorzellen , GFAP , EGFR , Primärkultur
Freie Schlagwörter (Englisch): CTC , DTC , single cell analysis , Glioblastoma multiforme , peripheral blood
Basisklassifikation: 44.81 , 44.90 , 42.13 , 42.15
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Heisig, Peter (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 05.07.2013
Erstellungsjahr: 2013
Publikationsdatum: 08.08.2013
Kurzfassung auf Deutsch: Das Glioblastoma multiforme (GBM) ist der bösartigste hirneigene Tumor im Erwachsenenalter. Trotz seiner ausgeprägten Aggressivität aufgrund eines invasiven und infiltrativen Wachstums disseminierter Tumorzellen innerhalb des Gehirns konnten bisher keine zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) im peripheren Blut von GBM-Patienten detektiert werden. Dennoch werden in seltenen Fällen extrakraniale Metastasen zumeist im Knochen, in den Lymphknoten, der Leber oder der Lunge detektiert. Auch die Transmission des GBM in Folge von Organspenden konnte in Fallbeobachtungen beschrieben werden. Das Ziel der vorliegenden Dissertation bestand darin, die ersten Hinweise auf das Vorliegen von CTCs in Patienten mit histologisch gesichertem GBM zu bestätigen und hierdurch die hämatogene Disseminierung von GBM-Zellen als Ausgangspunkt für die seltene systemische Metastasierung zu belegen. Dafür wurden zunächst Anreicherungs- und Detektionsmethoden für epitheliale CTCs an die Eigenschaften glialer Zellen angepasst bzw. für diese neu etabliert. Als Anreicherungsmethode wurde die Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation gewählt. Zur Detektion der angereicherten CTCs wurde eine Immunfärbung etabliert, die eine Identifikation der CTCs basierend auf ihrer Expression des sauren Gliafaserproteins (Glial Fibrillary Acid Protein = GFAP) ermöglicht. Die Spezifität dieser Immunfärbung wurde an angereicherten mononukleären Zellen des Blutes (MNC) aus gesunden Probanden sowie aus Karzinompatienten, bei denen Gehirnmetastasen diagnostiziert wurden, gezeigt. In Blutproben dieser beiden Kontrollgruppen wurden keine GFAP-positiven Zellen detektiert. Zum Nachweis des malignen Ursprungs GFAP-positiver Zellen wurden der Einzelzelltransfer, die sich daran anschließende Vermehrung der DNA über die WGA-Reaktion sowie Mutations-, Amplifikations- und FISH-Analysen an Einzelzellen von GBM-Zelllinien etabliert. Bei 23,7 % (27/114) der untersuchten GBM-Patienten konnten CTCs im Blut detektiert werden. Bei zwei dieser CTC-positiven Patienten wurde die maligne Herkunft dieser Zellen durch CGH-Analysen (Comparative Genomic Hybridisation = CGH) bewiesen. Des Weiteren konnten klinisch-pathologische Charakteristika der Primärtumore mit der Präsenz von CTCs im Patienten korreliert werden. Hierbei zeigte sich ein signifikanter Zusammenhang zwischen der CTC-Detektion und einer heterogenen GFAP-Expression bzw. einer starken EGFR-Amplifikation im Primärtumor. Außerdem konnten CTCs häufiger bei weiblichen als bei männlichen Patienten detektiert werden. Durch CGH-Analysen an durch WGA amplifizierter DNA aus Einzelzellen wurden Verluste auf dem Chromosom 10 sowie Zugewinne auf den Chromosomen 7 und 12 als häufige Aberrationen sowohl in Primärtumoren von CTC-positiven Patienten als auch in den analysierten CTCs selbst identifiziert. Der Nachweis von CTCs im Blut von GBM-Patienten könnte einen Hinweis darauf geben, dass systemische Metastasen weit häufiger auftreten als bisher vermutet. In der nur kurzen Nachbeobachtungszeit der in der vorliegenden Studie untersuchten Patienten konnten jedoch keine Fernmetastasierungen diagnostiziert werden. Die Detektion weiterer histopathologischer Parameter der Tumoren, welche die Fähigkeit zur hämatogenen Dissemination begünstigen, könnte zur Identifikation von CTC-positiven GBM-Patienten führen, die als Organdonatoren ausgeschlossen werden können. Dadurch könnten Organe von verstorbenen CTC-negativen GBM-Patienten möglicherweise zur Organtransplantation zugelassen werden, während gleichzeitig das Risiko einer Tumortransmission gesenkt werden würde. Die molekulare Charakterisierung der CTCs könnte darüber hinaus die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien, die sich gezielt gegen die in bzw. auf CTCs identifizierten Zielmoleküle richten, unterstützen (z.B. Anti-EGFR oder Anti-EGFRvIII-Therapie).
Da die molekulare Einzelzellanalyse von CTCs/DTCs bisher auf die genotypische Analyse beschränkt ist, gewinnt die weitere funktionelle Analyse dieser Zellen zunehmend an Bedeutung. Die erfolgreiche Etablierung von Zelllinien aus CTCs/DTCs konnte bisher nur in sehr wenigen Fällen beschrieben werden. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigte sich daher mit der in vitro-Expansion von CTCs/DTCs aus Blut- bzw. Knochenmarkproben zunächst von Karzinompatienten, da die prognostische Bedeutung von DTCs/CTCs in Patienten mit epithelialen malignen Tumoren durch eine Vielzahl von klinischen Studien belegt ist. Zur Optimierung der Wachstumsbedingungen wurden native Tumorzellen aus Pleurapunktaten von Karzinompatienten isoliert und kultiviert. Hierfür wurden verschiedene Anreicherungsmethoden im Hinblick auf den Vitalitätserhalt dieser Zellen getestet. Da nach der Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation gerade bei geringer Tumorzellzahl das beste Wachstum zu beobachten war, wurden CTCs/DTCs aus Patientenproben weiterhin mit dieser Methode angereichert. Des Weiteren wurden für die Kultivierung der Tumorzellen der Einsatz von murinen Fibroblasten als Feederlayer-Zellen, von verschiedenen Medienkompositionen und unterschiedlichen CO2-Konzentrationen getestet. In 4/216 (1,9 %) Patientenproben konnte eine Proliferation von epithelialen Zellen beobachtet werden, die sich allerdings nicht langfristig fortführen ließ. Durch die Optimierung der Wachstumsbedingungen konnte zusätzlich jeweils eine Zelllinie aus Tumorzellen des Pleurapunktates einer Mammakarzinompatientin sowie von Tumorzellen des Knochenmarks eines Harnblasenkarzinompatienten mit diagnostizierten Knochenmetastasen etabliert werden. Die weitere Charakterisierung dieser Zellen, insbesondere im Hinblick auf deren herabregulierte EpCAM-Expression könnte neue Erkenntinisse, z.B. über das Metastastasierungspotenzial dieser Zellen liefern. Diese neu etablierten Zelllinien könnten als Ausgangsmaterial für weitere tumorbiologische Untersuchungen sowie für Testungen der Sensitivität bzw. Resistenz gegenüber verschiedenen Therapeutika eingesetzt werden.
Kurzfassung auf Englisch: Glioblastoma multiforme (GBM) is one of the most common and aggressive malignant brain tumours in adults. Although this tumour is associated with a strong dissemination of tumour cells within the brain, circulating tumour cells (CTCs) have not yet been detected in the peripheral blood of patients. However, extracranial metastases have been reported in rare cases, located mainly in bone, lymph, nodes, liver or lung. Moreover, the development of secondary metastases in transplanted organs from donor GBM patients in initially cancer free recipients has been observed. The aim of the present study was therefore to confirm these first hints for a hematopoietic dissemination of GBM cells as point of origin for rare systemic metastases by proofing the presence of CTCs in patients with GBM.
For CTC enrichment and detection in GBM patients, methods previously established for the detection of CTCs derived from malignant epithelial tumours were adapted for the detection of tumour cells of glial origin. Thus, Ficoll density gradient centrifugation was used for CTC enrichment. To identify tumour cells within the enriched mononuclear cells (MNC) an immunostaining method was developed based on the expression of glial fibrillary acid protein (GFAP). The specificity of the staining was verified on MNC enriched from the blood of healthy volunteers and carcinoma patients with brain metastasis. No GFAP-positive cells were detected in the blood samples from either of these control groups. To prove the malignant origin of putative CTCs, the cells were further analysed for genomic changes such as chromosomal aberrations, gene mutations and gene amplifications.
GFAP-positive cells were detected in blood samples from 27/114 (23.7%) patients with GBM. GFAP-positive cells were more frequently detected in patients with EGFR gene amplification and heterogeneous GFAP expression in the corresponding tumour than in patients with no EGFR amplification in the primary. Furthermore, GFAP-positive cells were found more frequently in female than in male patients. A further analysis of individual GFAP-positive cells and DNA isolated from the corresponding primary tumours of two cases by chromosomal and array CGH, revealed shared genomic aberrations such as gains on chromosomes 7 and 12 and losses on chromosome 10.
The presence of CTCs in the blood of GBM patients may indicates that systemic metastasis occur much more frequently GBM patients than currently assumed. However, due to the short survival time of the patients in the present study no distant metastases were diagnosed. The identification of further histopathological parameters in tumours, favouring hematopoietic dissemination could enable the identification CTC-positive GBM patients. These Patients could than be excluded from becoming organ donators while CTC-negative GBM patients could still act as organ donors because of the lower risk of tumour transmission. In addition the molecular characterization of single CTCs could support the development of new therapeutic strategies, directed against identified target molecules in/on CTCs (i.e. anti-EGFR or anti-EGFRvIII-therapy).
Up to now the molecular single cell analysis of single CTCs/DTCs has been limited to genotype analysis. Thus, a further functional analysis of these cells, for example through the establishment of cell lines from DTCs/CTCs is of increasing importance. So far, the successful establishment of cell lines from CTCs/DTCs has been reported only very rarely. The second aim of the present study was therefore the in vitro expansion of CTCs/DTCs derived from blood or bone marrow samples. Owing to the prognostic relevance of CTCs/DTCs that has been demonstrated in multiple clinical studies of patients with epithelial tumours , samples from carcinoma patients were used for this purpose.
To optimize cell growth conditions, native tumour cells were isolated from pleural effusions from carcinoma patients and cultivated. The performance of different enrichment methods was tested, with regard to maintaining cell viability. Further parameters for the cultivation of tumour cells were also optimized, such as medium compositions, CO2-concentration and the use of murine fibroblasts as feeder layer cells. The proliferation of epithelial cells was detected in 4/216 patient samples. However, long term culture of these cells was not possible.
By optimizing culture conditions we were able to generate one cell line with tumour cells from pleural effusion fof one patient with mammary carcinoma and from MNC from one bladder cancer patient with bone metastasis. Further characterization of these cells, especially with regard to their down regulated EpCAM expression could give i.e. further information of the metastatic potential of these cells. These newly generated cell lines could be used as starting material for further tumour biological studies and to find out the response of these cells to different therapeutic approaches.

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