Substitution humaner Seren auf Basis der IgY-Technologie für die immunologische in vitro-Diagnostik

Abstract

Ziel der in vitro-Diagnostik ist die qualitative und quantitative Bestimmung spezifischer Antikörperisotypen. Zu diesem Zweck stehen zahlreiche im Laufe der Zeit etablierte und optimierte Systeme zur Verfügung. Trotz der klinischen Relevanz der in vitro-Diagnostik ist es erstaunlich, dass bis heute keine einheitliche Standardisierung vorgenommen wurde. Die Verwendung humaner Poolseren als Referenzmaterial in beispielsweise IgE-spezifischen Assaysystemen bietet zwar den Vorteil, der Problematik heterologer Gesamt-IgE-Standardkurven bei der quantitativen Bestimmung des sIgE zu entfliehen, ist allerdings in vielen Fällen mit dem Nachteil einer erschwerten Zugänglichkeit oder Verfügbarkeit, hoher Kosten und variierender Qualität behaftet.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden auf Basis der IgY-Technologie unterschiedliche Konzepte zur Umgehung dieser Problematik am Beispiel der Bet v 1a-induzierten Birkenpollenallergie erarbeitet und evaluiert. Zunächst konnten durch Immunisierungen von Hühnern mit dem Allergen Bet v 1a spezifische polyklonale Antikörper erhalten und aus dem Eigelb mit Hilfe der Präzipitation isoliert werden. In Analysen zur weiteren Charakterisierung konnten im ELISA-System unterschiedliche Effekte der Blockierungsreagenzien Polyvinylalkohol und bovines Serumalbumin auf das Bindungsverhalten der polyklonalen IgY festgestellt werden, wodurch die Diskriminierung der Affinitäten durch Immunisierung erhaltener Antikörper auf qualitativer Ebene möglich war. Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopische Untersuchungen zur Bestimmung der apparenten Affinität der allergenspezifischen IgY bestätigten die zuvor beobachteten Tendenzen.

Nach Generierung der spezifischen, polyklonalen Antikörper wurde die Realisation der für die human-immunologische in vitro-Diagnostik erforderlichen Adaption evaluiert. Hierzu wurden zum einen chemische Modifikationen mit Glutardialdehyd bzw. durch oxidative Glycolspaltung zur kovalenten Kopplung der IgY mit humanen Antikörpern untersucht. Darüber hinaus wurde auch eine Haptenmarkierung für die Detektion mit spezifischen humanen Isotypen und die nicht-kovalente Verknüpfung durch die Biotin-Streptavidin-Interaktion analysiert. Als zielführende Methode, da auf Modifikationen der IgY verzichtend und die Antigenspezifität erhaltend, wurde die genetische Fusion des gallinen IgY-spezifischen Rezeptors CHIR-AB1 mit dem humanen Fce-Teil etabliert. Dazu wurde die Sequenz des Rezeptors CHIR-AB1 amplifiziert und mit der humanen Fce-Sequenz in dem für die Expression in Mammaliazellen geeigneten Vektorsystem pcDNA3.1 fusioniert. Durch Expression in HEK-293-Zellen konnte das chimäre Konstrukt CHIR-AB1-huIgECH2-4 in vergleichsweise hoher Quantität erhalten und durch Affinitätschromatographie gereinigt werden. Die Untersuchung der Interaktion des Konstruktes mit IgY durch Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie ergab eine apparente Dissoziationskonstante im picomolaren Bereich. Mit Hilfe der genetischen Fusion der IgY-Spezifität mit der assayrelevanten Isotypspezifität wurde ein bivalentes und in seiner Affinität dem CHIR-AB1-Rezeptor gegenüber gesteigertes Konstrukt erhalten. CHIR-AB1-huIgECH2-4 wurde erfolgreich in Kombination mit den zuvor isolierten Bet v 1a-spezifischen IgY durch Vorinkubation in einem Festphasenassay getestet. Ebenso konnte das Konstrukt mit polyklonalen avianen Antikörpern mit Spezifität für den wässrigen Allergenextrakt aus Weizen erfolgreich angewendet werden und zeigte die generelle Übertragbarkeit des Konstruktes auf andere Assayanforderungen.

Der Vorteil des Konzeptes der genetischen Fusion gegenüber den anderen hier evaluierten Methoden liegt in dem Adaptionspotential des chimären Rezeptorkonstruktes. Durch Austausch der Fce-Sequenzen durch weitere im allergologischen, autoimmunologischen oder infektiologischen Kontext stehenden humanen Fc-Sequenzen wurden die analogen chimären Konstrukte für IgG1, IgG4, IgM, IgA1 und IgA2 produziert. Im Zusammenhang mit der autoimmunologischen Erkrankung einer heparininduzierten Thrombozytopenie II wurde CHIR-AB1-huIgG1CH2+3 erfolgreich mit IgY – spezifisch für den Komplex aus Plättchenfaktor 4 und heparinanalogem Dextransulfat – im Festphasenassay appliziert.

Mit den hier dargestellten chimären IgY-spezifischen Antikörperkonstrukten wurde ein vielseitiges Tool für die Substitution humaner Poolseren zur Verfügung gestellt, das die schnelle Adaption durch einfachen Fc-Austausch und die Applikation polyklonaler Hühner-Antikörper erlaubt. Unter Berücksichtigung tierschutzrechtlicher Bestrebungen zur Minimierung nachteiliger Effekte für das Labortier könnte sich nach Validierung in weiteren diagnostischen Systemen die seit langem geforderte Standardisierung für die in vitro-Diagnostik realisieren lassen.

Over the years, numerous different methods have been established and optimized for in vitro diagnostics with the objective of qualitative and quantitative determination of specific immunoglobulin isotypes. However, it is astonishing that in face of the clinical relevance of in vitro diagnostics no uniform standardization has been developed until now. The use of human pool sera as reference material for Ig-specific assays (e. g. IgE) provides the advantage to circumvent the problems arising with total IgE calibration curves. Nevertheless, human pool sera are associated in many cases with drawbacks due to accessibility, availability, high costs and variable quality.

In this work different concepts on the basis of the IgY technology were developed and evaluated to address these unsolved problems using the example of Bet v 1a induced birch pollen allergy. First of all Bet v 1a specific polyclonal antibodies were generated by immunization of hens and were isolated from hen’s egg yolk by salt precipitation. Further characterization experiments in ELISA revealed different blocking effects of polyvinyl alcohol and bovine serum albumin on the interaction of the polyclonal IgY, thereby allowing for qualitative discrimination of the affinity of antibodies produced via immunization. The apparent affinity of the allergen specific IgY was determined by surface plasmon resonance spectroscopy experiments, which confirmed the previously observed tendencies.

After generation of the specific and polyclonal antibodies several concepts for adaptation to human in vitro diagnostics were developed and evaluated. These concepts included a chemical modification with glutaraldehyde and oxidative cleavage of carbohydrate structures for covalent coupling of IgY with human immunoglobulins. Moreover, the decoration with haptens for specific detection by human isotypes and the non-covalent binding through strong interaction with streptavidin upon biotinylation were investigated. As a most promising method the genetic fusion of the galline IgY specific receptor CHIR-AB1 with the human Fce moiety was established. The CHIR-AB1 sequence was amplified and fused to the Fce gene by subcloning it into the mammalian expression vector pcDNA3.1. The chimeric CHIR-AB1-huIgECH2-4 was produced with relative high amount and purified by affinity chromatography. Surface plasmon resonance spectroscopic measurements determined an apparent dissociation constant in the picomolar range for the interaction of the construct with IgY. Thus, a bivalent and higher affine construct could be designed by means of genetic fusion of the receptor CHIR-AB1 with the relevant Fc part of human antibodies. CHIR-AB1-huIgECH2-4 was successfully applied as a preincubated combination with the previously isolated Bet v 1a specific IgY in solid phase assay. In addition the general ability for adaptation to other assay conditions was successfully demonstrated by application of the construct combined with IgY specific for the aqueous fraction of wheat extract.

This concept of genetic fusion is advantageous over the evaluated methods due to its potential for easy adaptation of the chimeric receptor construct. Within the context of further allergological, autoimmunological or infectiological relevant human immunoglobulin isotypes analogues of the receptor construct for IgG1, IgG4, IgM, IgA1 and IgA2 were designed. The heparin induced thrombocytopenia II served as a model for autoimmune diseases and CHIR-AB1-huIgG1CH2+3 in combination with IgY specific for the complex of platelet factor 4 and heparin-like dextransulfate were applied in solid phase assay. In this work IgY specific chimeric antibody constructs were designed as versatile tools for the substitution of human pool sera allowing for easy adaptation by the exchange of Fc moieties and application of polyclonal avian chicken antibodies. In consideration of animal health and welfare and upon validation for further diagnostic systems progress in the recommended and long-demanded standardization for in vitro diagnostics might now be achieved.