Selection and characterization of llama-derived anti-P2X7 single domain antibodies

Abstract

P2X7 ist ein ATP-gesteuerter Ionenkanal, der auf einer Vielzahl von Immunzellen exprimiert wird. Durch die ADP-Ribosylierung von Arg-125 durch die Toxin verwandte ADP-Ribosyltransferase 2 (ART2) kann der Purinrezeptor ebenfalls aktiviert werden. P2X7 vermittelt sowohl die Abspaltung von Zelloberflächenantigenen als auch den NICD induzierten Zelltod und wird mit unterschiedlichen Autoimmun- und inflammatorischen Krankheiten in Verbindung gebracht. Aufgrund dessen werden P2X7 Antagonisten als neue Therapeutika in Betracht gezogen. Einzeldomänenantikörper (VHHs oder Nanobodies) leiten sich von der variablen Domäne der Lama Schwerekettenantikörper (hcAbs) ab. Arbeiten aus unserer und anderen Arbeitsgruppen konnten nachweisen, dass VHHs die Eigenschaft aufweisen funktionelle Bereiche von Proteinen, wie das katalytisches Zentrum von Enzymen zu binden und zu blockieren. In dieser Arbeit wurden aus P2X7 immunisierten Lamas, Nanobodies (Nb) generiert und auf ihre Fähigkeit getestet P2X7 spezifisch zu binden und dessen Funktionalität zu modulieren. Für die Induktion von Schwerekettenantikörpern gegen natives murines und humanes P2X7 wurden Lamas mit cDNA Expressionsvektoren bzw. mit P2X7 stabil transfizierten Zellen immunisiert. Die spezifische P2X7 Antikörperantwort wurde mittels FACS-Analysen der Lamaimmunseren bestätigt. RNA wurde aus peripheren Blutlymphozyten isoliert und über Reverse Transkription in cDNA umgeschrieben. Das VHH-Repertoire wurde per PCR amplifiziert und in den Phagemid-Vektor, pAX50 kloniert. Die Phagenbibliotheken wurden auf Lymphomzellen, die endogen P2X7 exprimieren bzw. auf P2X7 transfizierten Zellen selektioniert. Es wurden 31 unterschiedliche Nb-Familien gewonnen, von denen 18 spezifisch murines P2X7 und drei spezifisch humanes P2X7 binden. Die Hälfte der anti-mP2X7 Nb-Familien beeinflussen die NAD+ und ATP vermittelte Aktivierung des Ionenkanals. Sechs Familien inhibieren die P2X7 vermittelte Abspaltung von CD62L, während drei andere die Aktivierung von P2X7 verstärken. Zwei der drei hP2X7 Familien blockieren die durch den Purinrezeptor vermittelte Abspaltung von CD62L und den Zelltod mit einer 10-50 fach höheren Wirkung als der beschriebene monoklonale Antikörper, L4. Die dritte spezifische hP2X7 Nb-Familie wirkt ähnlich wie der mAb L4 antagonistisch zum Purinrezeptor. Eine spezifische Bindung der beiden potenten mP2X7 Nbs (13A7 - Antagonist, 14D5 - Agonist) konnte in vivo nach intravenöser oder intraperitonealer Injektion nachgewiesen werden. Des Weiteren zeigte sich ex vivo eine Inhibierung bzw. Potenzierung der P2X7 vermittelten Abspaltung von CD27 und die Exposition von Phosphatidylserin. Es konnte gezeigt werden, dass die in vivo Bindung von 14D5 an P2X7 in der Maus zur partiellen Depletion der regulatorischen T Zellen führt. Um das therapeutische Potential der P2X7 Nbs zu untersuchen, wurden diese in einem Mausmodell der anti-Podozyten vermittelten Glomerulonephritis getestet. Hierbei konnte durch die Verwendung des inhibierenden Nbs 13A7 der Krankheitsverlauf gemildert werden, wobei der synergistische Nb 14D5 zu einem früheren und schwereren Krankheitsverlauf führte. Die in diesem Projekt generierten Nbs konnten ihren Nutzen als neue Forschungswerkzeuge bestätigen und zeigen Potential für die Anwendung in der Therapie.

P2X7 is an ATP-gated ion channel that is widely expressed on cells of the immune system. ADP-ribosylation by the toxin-related ADP-ribosyl transferase 2 (ART2) at Arg-125 also gates the purine receptor, likely by presenting the covalently linked ADP-ribose as an ATP-analog to the ligand binding pocket. P2X7 mediates shedding of cell surface antigens and cell death and reportedly is involved in several autoimmune and inflammatory diseases. Specific antagonists of the receptor have therefore been proposed as potential new therapeutics. Our research group and others have previously demonstrated that single domain antibodies (VHHs or Nanobodies) derived from llama heavy chain only antibodies (hcAbs) exhibit a propensity to bind to and block functional crevices on proteins such as the active site of an enzyme. In this study, Nanobodies (Nbs) were generated from P2X7-immunized llamas and tested for their capacity to specifically bind and functionally modulate P2X7. To induce antibodies against native P2X7, llamas were immunized with cDNA expression vectors for mouse and human P2X7 and with HEK cells transfected to stably express these receptors. The P2X7-specific antibody response was verified by FACS-analyses of sera obtained from immunized llamas. RNA was isolated from llama peripheral blood lymphocytes and reverse transcribed into cDNA. The VHH repertoire was PCR-amplified and cloned into the pAX50 phagemid vector. Panning phage libraries on lymphoma cells endogenously expressing P2X7 and on P2X7-transfected cell lines yielded 31 distinct Nb families. Eighteen of these were verified to specifically bind mouse P2X7, three to specifically bind human P2X7. Half of the anti-mP2X7 Nb families were found to modulate NAD+- and ATP-mediated activation of the ion channel: six families inhibited P2X7-mediated shedding of CD62L while three families potentiated the activation of P2X7. Two of three anti-hP2X7 Nb families blocked P2X7-mediated shedding of CD62L and cell death, with 10-50 fold higher potencies than the previously described L4 monoclonal antibody. The third hP2X7-specific Nb family antagonized the purine receptor with a potency similar to that of mAb L4. Following intravenous or intraperitoneal injection, the two most potent mP2X7-antagonizing (13A7) or potentiating Nbs (14D5) specifically targeted P2X7 in vivo and demonstrated inhibition or potentiation of P2X7-mediated nucleotide-induced shedding of CD27 and exposition of phosphatidylserine ex vivo. In vivo targeting of P2X7 by synergistic Nbs resulted in partial depletion of regulatory T cell subset. In a pilot experiment to test the potential therapeutic utility of P2X7-Nbs in the mouse model of anti-podocyte antibody mediated glomerulonephritis, the P2X7 inhibiting Nb 13A7 attenuated disease while the synergistic Nb 14D5 mediated an early onset and a more severe disease course. The Nbs generated in this project have demonstrated utility as new research tools hold promise as novel therapeutic tools.