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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-63814
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2013/6381/


Somatic Embryogenesis of Theobroma cacao L. : Developmental Physiology of the Embryo and Improvement of Culture Conditions

Somatische Embryogenese von Theobroma cacao L. : Physiologie der Embryonenentwicklung und Optimierung der Kulturbedingungen

Muller, Taina Soraia

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SWD-Schlagwörter: Somatische Embryogenese , Kakaobaum , Gewebekultur
Freie Schlagwörter (Deutsch): Theobroma cacao , Temporär Überfluss System , Mikrovermehrung , Saccharose , Phenolische Substanzen
Freie Schlagwörter (Englisch): Temporary immersion system , micropropagation , sucrose, phenolic substances , UV-microspectrophotometry
Basisklassifikation: 48.56 , 58.30 , 42.41
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Pflanzen (Botanik)
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Lieberei, Reinhard (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 03.05.2013
Erstellungsjahr: 2013
Publikationsdatum: 24.09.2013
Kurzfassung auf Englisch: Theobroma cacao is a plant native Amazon basin region which grows naturally in understory of tropical rainforests. It is a plant of Malvaceae family and cultivated since many centuries in tropical regions around the world. The economic importance due to the source for chocolate production makes this plant one of the most studied crops in the world. T. cacao cultures encounter problem like attack of severe diseases, high heterogeneity and difficult propagation. Its recalcitrant seeds and complex vegetative propagation hamper the mass propagation of clones and conservation of diversity. As example of other woody plants crop, modern biotechnological approaches have been employed seeking to overcome such problems. The use of bioreactors or systems of Temporary immersion (TIS) allowed to increase the production and to reduce the costs. The secondary somatic embryogenesis turned possible the establishment of cyclic cultures. Cyclic production of somatic embryos delivers high amounts of renewable plant material which can be taken from the culture cycle and submitted to physiological studies as well as for further establishment of new culture lines. This work studied the influence of various culture conditions on the production of cacao somatic embryos and on their late development up to conversion into plantlets. Cacao somatic embryos are known as showing a very poor accumulation of storage compounds. It may be the reason for high rate of somatic embryos lost observed during the steps that precedes plantlets establishment. In this work, the effect of different sucrose concentration added to the culture media as well as the different conditions for germination and conversion into plantlets were observed. Morphology and physiology of cacao secondary somatic embryos were investigated using a range of different techniques in order to provide a better understanding of the factors involved in embryos’ development. It was intent to identify favorable culture conditions enable to increase the production and the quality of cacao plantlets propagated via somatic embryogenesis. The use of TIS combined secondary somatic embryogenesis improved significantly the production of cacao somatic embryos which showed better quality than somatic embryos produced on solid medium. The production of high amounts of somatic embryos allowed the establishment of a cyclic culture of secondary somatic embryos. The heterogeneous population of somatic embryos found in the cultures allowed the morphological characterization of the seven stages of development, four stages during early developmental stages, globular, heart, torpedo and cotyledonary and 3 stages regarding growth, maturation and germination steps of the late development. The high production in a cyclic culture also permitted to carry out many physiological studies especially concerning phenolic substances as a key factor in the structural and physiological development of these embryos. UV-microspectrophotometry, a very sensitive and high specialized method allowed the topochemical investigation of phenolic compounds in the tissues of cacao somatic embryos. Distribution and accumulation of phenolic substances throughout the embryo development was observed. Lignification of cell walls of cotyledons of cacao somatic embryos was detected already in early stages of development. The content of phenolic compounds increased proportionally to embryo development and major part of phenolic substances was deposited in the cellular vacuole. Cells containing phenolic compounds in their vacuole were found mainly under the abaxial epidermis and nearly the vascular bundles. It indicates the accumulation of phenolic compounds to be a defense mechanism of these embryos. Similar distribuition of such cells was described also in zygotic embryos of cacao (Elwers et al., 2010). An enzyme closely related to phenolic metabolism is polyphenol oxidase (PPO), the activity of this enzyme in cacao seeds is well documented. In somatic embryos its activity seems to be related to germination process, since significant activity was detected only in hypocotyls of germinating somatic embryos. The activity of this enzyme during germination has been reported in various plants. During late development, cacao somatic embryos demonstrated inefficiency in accumulating storage compounds in the cotyledons; it was minimized with addition of high concentration of sucrose in the maturation media. The balance among the storage compounds, starch, sugars and proteins, was obtained in embryos maturated in culture medium containing 60 g L-1 sucrose. It was improved when somatic embryos was cultured under this conditions for only one week. However, it was observed that the stage of embryo development play an important role in the process of plantlets establishment. Somatic embryos at stage 6 of late development without maturation treatments showed the highest content of storage compounds. These also revealed germination and conversion into plantlets similar to embryos pre-treated in maturation medium, but only when germinated in darkness. Finally, it was possible to observe that a two factorial condition seems to lead to a better conversion of cacao somatic embryos into plantlets; the timely stage of the embryo submitted to maturation conditions and the sugar concentration in the culture medium. In conclusion, the latest step of the production of cacao plantlets via somatic embryogenesis can be successfully managed when considering the importance of time response of somatic embryos at latter stages of development to changes made in the culture medium.
Kurzfassung auf Deutsch: Der aus dem Amazonasbecken stammende Kakaobaum Theobroma cacao L. wächst
natürlicherweise im Unterholz tropischer Regenwälder. Infolge seiner großen wirtschaftlichen Bedeutung als Ausgangsstoff für die Schokoladenherstellung, zählt der Kakaobaum heute zu den am besten untersuchten Nutzpflanzen der Welt. Zu den größten Herausforderungen bei der Kultur von Kakao zählen nach wie vor der Umgang mit gefährlichen Krankheitserregern, die ausgeprägte Heterogenität zwischen den Bäumen sowie deren Vermehrung. Die recalzitranten Samen des Kakaobaums und seine aufwendige vegetative Vermehrung erschweren die Massenvermehrung von Kakaoklonen und den Erhalt ihrer Vielfalt. Mit Hilfe moderner biotechnologischer Verfahren wird versucht, diese Probleme zu überwinden. Der Einsatz von Bioreaktoren und temporären Immersionssystemen (TIS) ermöglicht eine Steigerung der Produktion somatischer Embryonen, bei gleichzeitiger Verringerung des Arbeitsaufwandes und damit der Kosten. Hinsichtlich der Mikrovermehrung von Kakao mittels somatischer Embryogenese konnten bereits beträchtliche Fortschritte erzielt werden. In vorliegender Arbeit wurde der Einfluss verschiedener Kulturparameter auf die Produktion somatischer Kakaoembryonen sowie deren spätere Entwicklung, bis hin zur Differenzierung in Jungpflanzen untersucht, wie auch wurde der Effekt unterschiedlicher Saccharose-Konzentrationen im Kulturmedium auf die Reifung der Embryonen untersucht. Während der anschließenden Keimung und Differenzierung der Embryonen in Jungpflanzen wurde der Einfluss verschiedener Kulturbedingungen betrachtet. Zum besseren Verständnis der die Embryonalentwicklung steuernden Faktoren, wurden sekundäre somatische Kakaoembryonen mit Hilfe verschiedener Verfahren morphologisch und physiologische untersucht. Ziel war es, die für die Produktivität und Qualität der somatischen Embryonen vorteilhaftesten Kulturbedingungen zu ermitteln. Die Verwendung eines TIS als Kultursystem in Kombination mit sekundärer somatischer Embryogenese führte zu einer signifikanten Qualitätssteigerung. Die hohen Produktionsraten ermöglichten die Etablierung einer zyklischen Kultur von sekundären somatischen Kakaoembryonen. Im Entwicklungsverlauf der Embryonen ließen sich morphologisch sieben verschiedene Entwicklungsstadien charakterisieren: vier davon - Globuläres, Herz-, Torpedo- und Cotyledonenstadium – treten während der frühen Entwicklung auf, die übrigen drei während der späteren Entwicklung (d.h. während Wachstum, Reifung und schließlich (Keimung der Embryonen). Der Schwerpunkt lag dabei insbesondere auf den phenolischen Inhaltsstoffen, denen eine Schlüsselfunktion bei der strukturellen und physiologischen Entwicklung der Embryonen zukommt. Mit Hilfe der sogenannten UV-
Mikrospektralphotometrie, wurden die phenolischen Substanzen in verschiedenen Geweben somatischer Kakaoembryonen topochemisch untersucht, und ihre Verteilung und Akkumulation im Entwicklungsverlauf der Embryonen betrachtet. Bereits in frühen Entwicklungsstadien ließ sich in den Cotyledonen der somatischen Kakaoembryonen eine Lignifizierung der Zellwände beobachten. Die phenolischen Inhaltsstoffe waren hauptsächlich in die Zellvakuole eingelagert und ihr Gehalt nahm im Laufe der Entwicklung zu. Die Zellen, die in ihren Vakuolen phenolische Substanzen eingelagert hatten, befanden sich vor allem unterhalb der abaxialen Epidermis sowie in der Nähe von Leitbündeln, was darauf hindeutet, dass die Akkumulation dieser Stoffe in den Embryonen eine Abwehrfunktion einnimmt. Ein eng mit dem Metabolismus phenolischer Substanzen verbundenes Enzym ist die Polyphenoloxidase (PPO). Bei den somatischen Kakaoembryonen steht die PPO-Aktivität offenbar in Verbindung mit dem Keimungsprozess: eine signifikante Enzymaktivität konnte ausschließlich in den Hypocotylen keimender somatischer Embryonen beobachtet werden. Während ihrer späten Entwicklungsstadien, zeigten die somatischen Kakaoembryonen eine verminderte Einlagerung von Speicherstoffen in ihre Cotyledonen. Durch den Zusatz hoher Mengen an Saccharose zum Reifungsmedium ließ sich die Akkumulation von Speicherstoffen steigern. Die größte Akkumulation von Speicherstoffen wurde nach einwöchiger Reifung der Embryonen bei einer Saccharosekonzentration von 60 g L-1
im Kulturmedium erzielt. Darüber hinaus ließ sich beobachten, dass das Entwicklungsstadium, in welchem die Embryonen mit dem Reifungsmedium inkubiert wurden, einen großen Einfluss auf die spätere Entwicklung der Kakaojungpflanzen hatte. Ohne Inkubation mit Reifungsmedium wiesen die Embryonen des Stadiums 6 der späten Embryonalentwicklung den höchsten Gehalt an Speicherstoffen auf. Wurden diese Embryonen im Dunkeln zum Keimen gebracht, zeigten sie morphologisch große Ähnlichkeit mit den im Reifungsmedium gewachsenen Embryonen. Die Differenzierung somatischer Kakaoembryonen zu Jungpflanzen ließ sich durch zwei Faktoren positiv beeinflussen: die Wahl des Entwicklungsstadiums, in welchem die Embryonen der Reifungsbehandlung unterzogen wurden, und die Zuckerkonzentration im Kulturmedium während der Reifung. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der letzte Schritt bei der Produktion junger Kakaopflanzen mittels somatischer Embryogenese erfolgreich gelingt, wenn das Zeitverhalten der somatischen Embryonen in den späteren Phasen ihrer Entwicklung berücksichtigt, und die Zusammensetzung des Kulturmediums entsprechend angepasst wird.

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