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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-64113
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2013/6411/


Die Rolle des C-Typ Lektins Dectin-1 im murinen Modell der experimentellen Leishmaniose

Zimara, Nicole

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SWD-Schlagwörter: Leishmania major , Dectin-1
Freie Schlagwörter (Deutsch): beta-Glucan , C-Typ Lektin
Basisklassifikation: 44.45
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Streit, Wolfgang (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 06.09.2013
Erstellungsjahr: 2013
Publikationsdatum: 17.10.2013
Kurzfassung auf Deutsch: Die obligat intrazellulären Parasiten der Gattung Leishmania (L.) major zählen zu den Erregern der kutanen Leishmaniose. Über den Biss einer Sandmücke werden die Erreger auf den Säugetierwirt übertragen, wo sie Zellen des mononukleären Systems befallen. Durch das Vorhandensein zweier Mausstämme, die auf Grund genetischer Unterschiede verschieden auf eine Leishmanieninfektion reagieren, konnten die Mechanismen, die über Suszeptibilität oder Resistenz entscheiden, im murinen Modell der Leishmaniose erforscht werden. Heute weiß man, dass zur Beseitigung der Parasiten eine T-Helferantwort vom Typ 1 (Th1-Antwort) notwendig ist. Dadurch schütten CD4+ T-Helferzellen Interferon (IFN) -γ aus, wodurch Makrophagen zur Produktion von leishmaniziden Molekülen, wie z.B. Stickstoffmonoxid, angeregt werden. Dies führt schließlich zur Beseitigung der Leishmanien.
Dendritische Zellen (Dendritic cell, DC) gelten als wichtiges Bindeglied zwischen angeborenem und erworbenem Immunsystem. Sie nehmen Antigene auf, prozessieren sie und präsentieren sie schließlich antigenspezifischen T-Zellen. Aus diesem Grund erhofft man sich, dass durch die zielgerichtete Aktivierung von Endozytoserezeptoren auf diesen Zellen die Immunantwort gegen einige Krebserkrankungen, aber auch virale Erreger oder Leishmanien so verändert werden kann, dass eine effektive T-Zellantwort induziert wird. Besonders Rezeptoren der C-Typ-Lektin-Familie haben sich in vielen Studien bereits als vielversprechende Ziele erwiesen.
In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob durch die Aktivierung des C-Typ-Lektins Dectin-1 über seinen Ligand Curdlan die Immunantwort auf eine Infektion mit L. major verändert werden kann, so dass suszeptible Mäuse eine protektive Th1-Antwort entwickeln.
Es konnte in vitro gezeigt werden, dass die Stimulation von Bone marrow derived DCs (BMDCs) aus suszeptiblen Mäusen mit Leishmanien in Kombination mit Curdlan nicht nur den Anteil Dectin-1+ Zellen in der Kultur erhöht, sondern auch zur Reifung der Zellen führt. Dies lieferte erste Hinweise darauf, dass Dectin-1 für den Verlauf der Leishmaniose wichtig sein könnte, da die Parasiten alleine die Reifung von DCs unterdrücken. Außerdem erhielten wir erste Anhaltspunkte, dass das Zytokinprofil der BMDCs von BALB/c in Richtung einer Th1-Antwort verschoben wird.
Auch in vivo konnten wir bestätigen, dass die Anzahl Dectin-1+ - Zellen nach Infektion mit L. major anstieg. Eine Infektion suszeptibler Mäuse in Kombination mit Curdlan führte zur Entwicklung einer Resistenz gegenüber den Parasiten. Die Tiere konnten die Infektion bekämpfen und waren darüber hinaus bei einer erneuten Infektion ebenfalls resistent. Eine positive Delayed Type Hypersensitivity (DTH) – Reaktion, der Anstieg der IgG2a – Konzentration in den Seren der BALB/c - Mäuse und nicht zuletzt die Messung von Zytokinen in Zellkulturüberständen, die für eine Th1-Antwort typisch sind (etwa IFN-γ), deuteten auf eine Verschiebung der Th1/Th2-Balance in Richtung Th1. Nachdem wir suszeptiblen Mäusen Leishmanienantigen in Kombination mit Curdlan injiziert hatten, waren diese Tiere deutlich länger dazu in der Lage, eine darauf folgende Infektion mit lebenden Parasiten in Schach zu halten. Mit Hilfe von Dectin-1 – Knock-Out – Mäusen konnten wir schließlich beweisen, dass die durch Curdlan hervorgerufenen Effekte über Dectin-1 vermittelt werden.
Parasitologisch konnten wir nachweisen, dass Leishmanien Liganden verschiedener C-Typ-Lektine auf ihrer Oberfläche exprimieren. Im Vergleich ist die Expression der Dectin-1 – Liganden aber deutlich reduziert, was darauf schließen lässt, dass es sich hierbei um einen sog. Escape - Mechanismus handelt, durch den die Erreger vom Immunsystem des Wirtes unentdeckt bleiben wollen. Außerdem zeigten die Ergebnisse, dass die Expressionsstärke der Liganden innerhalb einer Leishmanienpopulation unterschiedlich ist, was darauf schließen lässt, dass die sexuelle Reproduktion von Leishmanien häufiger vorkommt als bisher angenommen, was auch durch neuere Studien bestätigt wird.

Diese Ergebnisse zeigten, dass die Immunantwort suszeptibler BALB/c – Mäuse auf eine Infektion mit L. major mit Hilfe des β-Glucans Curdlan so moduliert werden kann, dass die Tiere eine adaptive protektive Th1-Antwort entwickeln. Dabei spielt das C-Typ-Lektin Dectin-1 eine entscheidende Rolle. Außerdem gelang es uns, suszeptible Mäuse zu immunisieren, so dass der Krankheitsverlauf einer nachfolgenden Leishmaniose abgeschwächt verlief. Aus diesem Grund halten wir Dectin-1 für eine vielversprechende Grundlage weiterer Untersuchungen, um eine effektive, auf DCs basierende Vakzinierung gegen Leishmaniose zu entwickeln.
Kurzfassung auf Englisch: Obligatory intracellular parasites of the genus Leishmania (L.) major belong to the causative agents of cutaneous leishmaniasis. The parasites, which are transmitted to the mammalian host via the bite of a sand fly, infect cells of the mononuclear system. The mechanisms deciding on susceptibility or resistance have been investigated using the murine model of leishmaniasis. This animal model has the advantage that two different mouse strains exist, which cope differently with the infection due to certain genetic diversities. Today it is known that for parasite clearance, the development of a protective Th1 response is necessary. CD4+ helper T cells produce interferone (IFN) –γ, which activates macrophages and induces the production of leishmanicidal molecules, e.g. nitric oxide, Finally leading to the elimination of the parasites.
Dendritic cells are considered to be important for bridging the innate and adaptive immune system. They take up antigens to process and present them to antigen-specific T cells. For this reason, the target-oriented activation of endocytic receptors on this cell type was expected to modify the immune response against cancer, viral pathogens or parasites like Leishmania in a way that an effective T cell response is induced. Several studies have shown that especially receptors of the C-type lectin family represent promising targets.
In this thesis we examined if the activation of the C-type lectin dectin-1 by binding to its ligand curdlan leads to an alteration of the immune response against L. major, so that susceptible mice can develop a protective Th1 response.
We could show in in vitro experiments that stimulation of bone marrow-derived DCs (BMDCs), isolated from susceptible mice, with Leishmania and Curdlan leads to an increased portion of dectin-1+ cells as well as to the maturation of the BMDCs. These results provided a first hint that dectin-1 could play a role in the course of disease, since stimulation with parasites alone suppresses the maturation of the cells. Moreover, we got evidence for a shift in the cytokine profile of the BMDCs of BALB/c towards a Th1 response.
We could confirm an increase of the number of dectin-1+ cells after infection with L. major in vivo. Infection in combination with curdlan made susceptible mice resistant to the parasites. Moreover, the animals were also able to successfully mount an immune response after re-infection. A positive delayed type hypersensitivity (DTH) – reaction, an increase of the IgG2a – concentration in the sera of the BALB/c – mice and, last but not least, the presence of cytokines specific for Th1 responses (e. g. IFN-γ) in cell culture supernatants were indicating a shift of the Th1/Th2 balance in BALB/c – mice towards Th1. After administering Leishmania-antigen in combination with curdlan to susceptible BALB/c mice, these animals were able to control a subsequent infection with live parasites for a considerably longer period of time. By using dectin-1 – knock-out mice we were could explicitly demonstrate that the effects caused by curdlan are mediated by dectin-1.
Concerning parasitology, we were able to show the expression of C-type lectin ligands on the surface of Leishmania parasites. Compared to other ligands, the expression of ligands for dectin-1 was clearly reduced, suggesting an escape mechanism which enables the parasites to evade the host immune surveillance. Moreover, the results reveal diverging expression levels of ligands for C-type lectins within a Leishmania population, indicating sexual reproduction of Leishmania occurs more often than assumed.

The results show that the immune response of susceptible BALB/c mice to an infection with L. major can be modulated by using the β-glucan curdlan in a way that animals develop an adaptive protective Th1 response. We were able to identify the C-type lectin dectin-1 as indispensable factor in this mechanism. Moreover, we successfully immunized susceptible mice resulting in a less severe course of disease and a prolonged survival of the animals. Therefore, we consider dectin-1 as a promising target for further investigations leading to the development of an effective DC-based vaccination against leishmaniasis.

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