Funktionelle Analyse des Transkriptionsfaktors „Grainyhead-like 2“ (GRHL2) und dessen pathophysiologische Relevanz beim humanen Mammakarzinom

Abstract

Grainyhead-like 2 (GRHL2) ist ein Mitglied der Grainyhead-Familie von Transkriptionsfaktoren, die eine wichtige Rolle in der Embryonalentwicklung sowie bei der Wundheilung spielen. Mit Hilfe eines genetischen Screenings, einer so genannten Retrovirus-vermittelten cDNA-Expressionsklonierung, wurde GRHL2 zunächst als neues Proto-Onkogen identifiziert, das dazu in der Lage ist, eine Transformation von NIH3T3-Fibroblasten zu bewirken. Ziel dieses Promotionsvorhabens war es daher, die mögliche Relevanz des bisher noch weitestgehend uncharakterisierten Transkriptionsfaktors GRHL2 bei der Entstehung und Progression des humanen Mammakarzinoms zu untersuchen. Insgesamt wurden vier verschiedene experimentelle Ansätze gewählt, um die Funktion von GRHL2 in humanen Mammakarzinomzelllinien in vitro zu klären. Diese Modellsysteme beinhalteten die Überexpression von GRHL2 in MDA MB 231-Mammakarzinomzellen und in der normalen Mammaepithelzelllinie MCF 10A sowie den shRNA-vermittelten Knockdown der GRHL2-Expression und die funktionelle Inaktivierung von GRHL2 über dominant-negative wirkende GRHL2-Proteine in MDA MB 468-Mammakarzinomzellen. Die wichtigsten Resultate aus diesen experimentellen Systemen können wie folgt zusammengefasst werden: - Es konnte gezeigt werden, dass GRHL2 die Proliferation von Mammakarzinomzellen reguliert und somit onkogene Eigenschaften besitzt. - Der Transkriptionsfaktor GRHL2 reguliert direkt die Expression des ERBB3/HER3-Rezeptors in Mammakarzinomzellen. Die Identifikation von ERBB3/HER3 als direktes Zielgen von GRHL2 ist für das Mammakarzinom von entscheidender Bedeutung, da ein veränderter Aktivierungszustand des ERBB3/HER3-Proteins beim humanen Mammakarzinom mit einer schlechteren Überlebensrate in Verbindung gebracht wird und er bei einer zielgerichteten Therapie zur Vermittlung von Resistenzen beiträgt. - Das wichtigste Resultat dieser Arbeit stellt die Identifizierung von GRHL2 als neuen Suppressor der epithelialen-mesenchymalen Transition (EMT) in Mammakarzinomzellen dar. - GRHL2 hat eine antagonisierende Wirkung auf die TGF-β-induzierte EMT in MCF 10A-Mammaepithelzellen. - Die GRHL2-Expression wird direkt durch den EMT-Transkriptionsfaktor zinc-finger-enhancer binding protein 1 (ZEB1) supprimiert, der wiederum ein Ziel für die Repression durch GRHL2 darstellt. Diese Resultate lassen den Schluss zu, dass GRHL2 und ZEB1 eine doppelt-negative, die Transkription regulierende, Feedback-Schleife bilden, die die EMT, die Migration, die Invasion und die Metastasierung in Mammakarzinomzellen steuert. - Vorläufige Resultate zeigen, dass GRHL2 die Metastasierung von Mammakarzinomzellen in vivo hemmt. - Es wurden Anzeichen dafür gefunden, dass die Aktivität des GRHL2-Transkriptionsfaktors in Mammakarzinomzellen durch posttranslationale Modifikationen (PTMs) gesteuert wird. Insbesondere spielt dabei die Aminosäure Threonin211 (T211) eine entscheidende Rolle, die als neue, mögliche Phosphorylierungsstelle einer bisher noch unbekannten Kinase identifiziert werden konnte. Zudem ist es gelungen, aktivierungsspezifische Antikörper herzustellen, die das an T211 phosphorylierte Protein erkennen und für weitere Studien eingesetzt werden können. Zusätzlich zu diesen funktionellen Untersuchungen wurde eine immunhistochemische Analyse der GRHL2-Proteinexpression an primären Brusttumoren vorgenommen. Im Einklang mit der Funktion als EMT-Suppressormolekül wurde eine Abnahme der GRHL2-Expression an der Invasionsfront der Primärtumoren beobachtet. Eine pathophysiologische Relevanz zeigte sich zudem durch die statistisch signifikante Korrelation zwischen dem Verlust der GRHL2-Expression in den Mammakarzinomen und dem Auftreten von Lymphknotenmetastasen. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass verschiedene Zellsysteme zur Charakterisierung des GRHL2-Gens etabliert werden konnten. Die damit erzielten Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Transkriptionsfaktor GRHL2 eine doppelte Funktion während der Tumorprogression einnimmt, in dem er sowohl die Zellproliferation reguliert als auch als Suppressor der EMT in Mammakarzinomzellen fungiert. Die Resultate weisen auf eine große pathophysiologische Relevanz des GRHL2-Gens für das Mammakarzinom hin und könnten die Grundlage für weitere Untersuchungen zur immer noch unvollständig verstandenen und sogar gegensätzlichen Rolle des GRHL2-Transkriptionsfaktors beim humanen Mammakarzinom bilden.

Grainyhead-like 2 (GRHL2) is a member of the grainyhead family of transcription factors which play a crucial role during embryonic development and wound healing. Using a retrovirus-mediated cDNA expression cloning approach, we originally identified GRHL2 as a novel protooncogene capable of transforming NIH3T3 fibroblasts. The aim of the PhD project therefore was to start to define the putative pathophysiological relevance of the yet largely uncharacterized transcription factor GRHL2 in breast cancer development and progression. A total of four distinct experimental systems for analysis of GRHL2 function in human breast cancer cells were generated and used for in vitro studies. These model systems include overexpression of GRHL2 in MDA MB 231 breast cancer and MCF 10A mammary epithelial cells as well as a shRNA-mediated knockdown of GRHL2 expression and functional inactivation of GRHL2 using dominant-negative GRHL2 proteins in MDA MB 468 breast cancer cells, respectively. The most important findings employing these experimental breast cancer systems can be summarized as follows: - GRHL2 is a potent regulator of breast cancer cell proliferation, thus confirming the oncogenic potential of GRHL2 in human cancer cells. - The transcription factor GRHL2 directly regulates expression of the ERBB3/HER3 receptor in breast cancer cells. The identification of ERBB3/HER3 as a GRHL2 target gene has very important implications for breast cancer in that an abnormal activation of ERBB3/HER3 has been linked to decreased survival in breast cancer and has been functionally involved in resistance to targeted therapies. - Most importantly, GRHL2 could also be identified as a novel suppressor of the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) in breast cancer cell lines. - GRHL2 antagonizes TGF-β induced EMT in MCF 10A mammary epithelial cells. - Expression of GRHL2 is directly suppressed by the EMT transcription factor Zinc finger E-box-binding homeobox 1 (ZEB1) which in turn is a direct target for repression by GRHL2, suggesting that GRHL2 and ZEB1 form a double-negative transcriptional regulatory feedback loop regulating EMT, migration, invasion, and metastasis of breast cancer cells. - Preliminary results suggest that GRHL2 represses the metastasis of breast cancer cells in vivo. - Evidence is provided that the activity of the GRHL2 transcription factor in breast cancer cells is modulated by posttranslational modifications (PTMs). In particular, residue Threonine211 (T211) could be identified within the GRHL2 protein as a potential phosphorylation site by a yet unknown kinase. Activation-specific polyclonal antibodies for the detection of T211-phosphorylated GRHL2 proteins were generated and could be used for further studies. In addition to these functional studies, a comprehensive immunohistochemical analysis of GRHL2 protein expression in primary breast cancers was performed. Consistent with its role as an EMT-suppressor molecule, a loss of GRHL2 expression at the invasive front of primary tumors was observed. A pathophysiological relevance in breast cancer metastasis was further demonstrated by our finding of a statistically significant association between loss of GRHL2 expression in primary breast cancers and lymph-node metastasis. In conclusion, different experimental cell systems for functional characterization of the GRHL2 gene were generated. The results strongly suggest dual roles of GRHL2 in breast cancer progression in that the GRHL2 transcription factor regulates both cell proliferation and EMT-like phenotypical and gene expression changes in breast cancer cells. The results demonstrate a strong pathophysiological relevance of the GRHL2 gene in breast cancer and could pave the way for further investigations of the still enigmatic or even contradictory roles of the GRHL2 transcription factor in breast cancer.