FAQ
© 2015 Staats- und Universitätsbibliothek
Hamburg, Carl von Ossietzky

Öffnungszeiten heute09.00 bis 24.00 Uhr alle Öffnungszeiten

Eingang zum Volltext in OPUS

Hinweis zum Urheberrecht

Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-65007
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2013/6500/


Regulation des subzellulären Transports von HCN1-Kanälen durch assoziierte intrazelluläre Proteine

Wilkars, Wiebke

pdf-Format:
 Dokument 1.pdf (6.851 KB) 


SWD-Schlagwörter: Neurobiologie, Ionenkanal , Intrazellulärer Transport
Freie Schlagwörter (Deutsch): HCN1, TRIP8b, Nedd4-2, SNX3
Basisklassifikation: 42.13
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Bender, Roland (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 25.10.2013
Erstellungsjahr: 2013
Publikationsdatum: 09.12.2013
Kurzfassung auf Deutsch: Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Beeinflussung des subzellulären Transports von HCN1-Kanaluntereinheiten durch assoziierte intrazelluläre Proteine untersucht. HCN-Kanäle sind spannungsabhängige Ionenkanäle, die während der Hyperpolarisation der Zellmembran aktiviert werden und über einen Einstrom von Natriumionen zu einer Depolarisation führen. Damit bereiten sie zum einen die Nervenzelle auf die Ausbildung eines neuen Aktionspotentials vor, zum anderen wirken sie aber auch regulierend auf die verschiedenen Einflüsse, denen ein Neuron in einem neuronalen Netzwerk ausgesetzt ist. Die exakte Funktion von HCN-Kanälen ist zudem abhängig von ihrer subzellulären Lokalisation. Diese kann sich in Abhängigkeit der Neuronenpopulation unterscheiden. Wichtig für die Regulation des subzellulären Transports sind posttranslationale Modifikationen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Fokus vor allem auf nicht-kovalente posttranslationale Modifikationen gelegt, d. h. die feste Assoziation von β-Untereinheiten oder die Interaktion mit intrazellulären Transportproteinen, die regulierend auf die Oberflächenexpression oder die Degradation von Kanälen des HCN1-Typs wirken können. Diese Arbeit gliederte sich zum einen in die Untersuchung einer bereits bekannten β-Untereinheit der HCN1-Kanäle, dem Rab8b-interagierenden Protein TRIP8b, zum anderen wurden zwei bisher unbekannte Interaktionspartner von HCN1-Kanälen identifiziert: die Ubiquitin-Ligase Nedd4-2 und das Sorting Nexin 3, ein am Retromerkomplex beteiligtes Transportprotein. Diese drei Proteine wurden hinsichtlich ihrer Bedeutung für den subzellulären Transport von HCN1 sowohl mit zellbiologischen, als auch mit biochemischen und immunhistochemischen Methoden untersucht.

Die Untersuchung des Einflusses von TRIP8b erstreckte sich auf die beiden hauptsächlich im Gehirn exprimierten Isoformen, TRIP8b(1a-4) und TRIP8b(1a), und ihre Funktion an der Regulation des axonalen Transports von HCN1. Diese Experimente wurden am etablierten Tractus perforans-Modell durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass die Isoform TRIP8b(1a) den Transport von HCN1 in diesen Neuronen dahingehend beeinflusst, dass die Interaktion zu einer Steigerung der somato-dendritischen und Reduktion der axonalen HCN1-Expression führt. Für TRIP8b(1a-4) konnte dieser Effekt nicht beobachtet werden.

Die Ubiquitin E3-Ligase Nedd4-2 wurde als Protein identifiziert, das mit HCN1 über ein erweitertes \\\"PY\\\"-Motiv im C-Terminus der Kanäle interagiert. Die HCN1-Nedd4-2-Interaktion führt zur verstärkten Ubiquitinylierung der Kanäle und einer Veränderung des Glykosylierungsstatus. Außerdem reduziert sich in Anwesenheit von Nedd4-2 der relative Anteil von an der Zelloberfläche exprimiertem HCN1 bei gleichzeitiger Stabilisierung des internen HCN1.

Das Sorting Nexin 3 wurde als Interaktionspartner mittels eines \\\"Yeast Two-Hybrid\\\"-Systems identifiziert und die Interaktion im Rahmen dieser Arbeit charakterisiert. Es handelt sich hierbei um ein Mitglied des Retromerkomplexes, welcher den Transport von endocytierten Transmembranproteinen zum Trans-Golgi-Netzwerk vermittelt. Es konnte gezeigt werden, dass SNX3 und HCN1 überlappende Expressionsmuster im Gehirn aufweisen. Eine Interaktion beider Proteine konnte in vitro und in situ nachgewiesen werden.

Die in dieser Arbeit vorgestellten Befunde tragen zu einem erweiterten Verständnis der Regulationsmechanismen des intrazellulären Transports von HCN1-Kanälen bei, die bisher noch weitgehend unbekannt sind. Sie bieten einen guten Ausgangspunkt zur weiteren Erforschung der komplexen Maschinerie, die die Funktion von HCN-Kanälen in Neuronen reguliert.
Kurzfassung auf Englisch: In this work, the influence of the intracellular binding proteins on the subcellular transport of HCN1 channel subunits was investigated. HCN channels are voltage-dependent ion channels that activate upon hyperpolarization of the plasma membrane and lead to depolarization via an inward current of mainly sodium ions thus facilitating the generation of a new action potential and regulating the properties of individual neurons, as they get different input from other cells in the neuronal network. However, the precise function of HCN channels is dependent on their subcellular localization, which can vary in different neuronal populations. Due to the fact that the mechanisms that mediate the subcellular transport of ion channels often include the association with intracellular binding proteins such as β-subunits or proteins of the cellular sorting machinery, the role of known HCN1 associated proteins, the Rab8b-associated protein TRIP8b, as well as two newly identified HCN1-binding proteins - Nedd4-2 and SNX3 - was examined in this study using cell biology, biochemical and immunhistochemical methods.

The investigation of the influence of TRIP8b focused on the two major isoforms in the brain, TRIP8b(1a-4) and TRIP8b(1a), and additionally on their functionality within the regulation of the axonal transport of HCN1. These experiments were performed by using the established perforant path model. The presence of TRIP8b(1a), but not TRIP8b(1a-4), leads to a shift of the HCN1 expression towards the somato-dendritic compartment with a simultaneous reduction of its axonal expression.

The ubiquitin E3-ligase Nedd4-2 was identified as a binding protein of HCN1 interacting via an extended PY-motif in the HCN1 C-terminus. This interaction causes the ubiquitination of HCN1 followed by subsequent proteasomal or lysosomal degradation. Nedd4-2 thus regulates the surface expression of HCN1.

Sorting Nexin 3 (SNX3) was identified as an interaction partner using the yeast two-hybrid system and the interaction was further characterized. SNX3 is a member of the retromer complex that governs the transport of endocytosed transmembrane proteins towards the trans-golgi network. It was shown that SNX3 and HCN1 have overlapping expression patterns in the brain. Interaction of both proteins could be further demonstrated in vitro and in situ.

The results presented in this work contribute to an extended understanding of regulation of the intracellular transport of HCN1 subunits that is widely unknown at the moment. The investigation and characterization of several, partially unknown interaction partners acting differently on the regulation of HCN channels provide a promising base for a further exploration of the complex machinery that govern these trafficking processes.

Zugriffsstatistik

keine Statistikdaten vorhanden
Legende