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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-65123
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2013/6512/


Structure-Function-Analysis of Pathogenicity Associated Proteins YopP of Yersinia enterocolitica and Rv2140c of Mycobacterium tuberculosis

Struktur-Funktions-Analyse der Pathogenizitäsproteine YopP von Yersinia enterocolitica und Rv2140c von Mycobacterium tuberculosis

Eulenburg, Georg zu

Originalveröffentlichung: (2013) http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S001457931300567X
pdf-Format:
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Freie Schlagwörter (Deutsch): Acetylierung , Posttranslationale-Modifikation , Kinetik , MAP-Kinase, Phospholipide
Freie Schlagwörter (Englisch): Acetylation , Post-Translational-Modification , kinetics , MAP-Kinase , Phospholipids
Basisklassifikation: 42.13 , 35.76 , 42.30 , 35.73 , 35.71
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Betzel, Christian (Prof. Dr. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 08.11.2013
Erstellungsjahr: 2013
Publikationsdatum: 10.12.2013
Kurzfassung auf Englisch: YopP
Human pathogenic Yersinia spp. translocate the acetyltransferase Yersinia Outer Protein P (YopP) in host immune cells, where it suppresses the expression and secretion of pro-inflammatory cytokines and contributes to the induction of apoptosis. YopP is activated through binding to the host factor IP6 and uses acetyl-CoA as a cofactor to acetylates serine and threonine residues in the activation loop of kinases, which prevents phosphorylation of these residues and the activation of the kinases.
Binding constants of YopP to its activator IP6 as well as to CoA were determined to be in the low μM range and the energetic profile of the YopP/CoA/IP6 interaction suggests cooperativity in binding events if both ligands are present. The C-terminus of YopP was found to undergo self-degradation. Binding of IP6 to YopP protects the C-terminus of YopP partially from limited proteolysis, suggesting that the C-terminus is partially intrinsically disordered prior to IP6 binding. Attempts to crystallize YopP in order to get a high resolution X-ray crystal structure failed. Full length YopP as well as several truncated constructs tended to aggregate and precipitate easily. Despite numerous efforts aggregation and precipitation of YopP could not be prevented by binding to its ligands or by use of optimized buffers. A homologous protein, Salmonella enterica AvrA also failed to form protein crystals.
The poor stability of YopP suggests that further bacterial and/or host factors are required to stabilize YopP. Bacterial proteins SycO and orf91a were tested for their possible interaction with YopP, but no interaction with YopP was observed under the conditions tested. It was also determined that YopP does not form a stable complex with its human kinase target MEK2.
A colorimetric assay, which allows the investigation of the kinetics of the acetylation reaction of MEK2 by YopP was established. It was shown that YopP undergoes auto-acetylation in presence of acetyl-CoA independent of the kinase substrate. The auto-acetylation step is accelerated significantly by IP6. The acetyl transfer from YopP to the kinase does not follow simple Michaelis-Menten kinetic mechanism; instead it appears to follow a complicated multi substrate reaction mechanism. The assay suggests that a slow monoacetylation MEK2 precedes a faster acetylation of the second acetlyation site. The physiological relevance and consequences of monoacetylated kinases remains to be determined.
Rv2140c
Expression of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) protein Rv2140c is up-regulated in the phagocytosed Mtb. A crystal structure revealed that Rv2140c could be a phosphatidyl-enthanoamine (PE) binding protein and NMR experiments suggest, that it binds to the cell migration inhibitor locostatin. Binding studies with a number of short chain PE analogues revealed a low mM affinity of the Rv2140c/PE interaction, which confirmed that Rv2140c is a PE binding protein. To investigate the in vivo significance Rv2140c, a mutant strain of Mycobacterium smegmatis was generated, where the homologue of Rv2140c, MSMEG_4199 was deleted. The growth of M. smegmatis is not impaired by the deletion of MSMEG_4199 and addition of locostatin affects both the growth of wild type and mutant strain in the same manner, suggesting that locostatin has other mycobacterial interaction partners, which overrule the effect of locostatin on MSMEG_4199.
Kurzfassung auf Deutsch: YopP
Humanpathogene Yersinia spp. translozieren die Acetyltransferase Yersinia Outer Protein P YopP in humane Immunzellen. YopP verhindert die Expression und Sekretion von entzündungsfördernden Zytokinen durch Immunzellen und trägt zur Induktion von Apoptose in diesen Zellen bei. YopP wird durch das Wirtsmolelül IP6 aktiviert und verwendet Acetyl-CoA als Ko-Faktor um Serin und Threonin Seitenketten in der Aktivierungsschleife von Kinasen zu acetylieren. Die Acetylierung dieser Aminosäuren verhindert deren Phosphorylierung und somit die Aktivierung dieser Kinasen.
Die Bindungskonstanten von YopP zu seinem Aktivator IP6 sowie zu CoA wurden bestimmt und liegen im Bereich von wenigen μM. Das energetische Profil der YopP/CoA/IP6 Wechselwirkung deutet auf eine Kooperativität der Bindung der beiden Liganden hin. Der carboxyterminale Bereich von YopP scheint intrinsisch ungeordnet zu sein und degradiert über einen Zeitraum. Das Binden von IP6 an YopP verhindert weitgehend den carboxyterminalen Abbau von YopP durch Proteasen. Versuche YopP zu kristallisieren um eine hochauflösende Röntgenkristallstruktur zu erhalten waren nicht erfolgreich. Sowohl das Volllängenprotein, als auch verschiedene verkürzte Proteinkonstrukte erwiesen sich als hochgradig Instabil und neigten zu Aggregation und Präzipitation. Weder Bindung zu Liganden noch die Verwendung von verschiedenen Puffersystemen konnte YopP stabilisieren. Ebenso schlugen Versuche fehl, Salmonella enterica AvrA, ein homologes Protein zu kristallisieren.
Die Instabilität von YopP könnte bedeuten, dass weitere bakterielle- oder Wirtsfaktoren benötigt werden, um YopP zu stabilisieren. Die bakteriellen Proteine SycO und orf91a wurden auf eine mögliche Interaktion mit YopP untersucht, aber unter den experimentellen Bedingungen konnte keine Wechselwirkung festgestellt werden. Ebenso wurde festgestellt, das YopP keinen stabilen Komplex mit der humanen Kinase MEK2 bildet.
Es wurde eine kolorimetrische Methode etabliert, die es erlaubt, die Kintetik der Acetyltransferasereaktion zu untersuchen. Dabei wurde herausgefunden, das IP6 die Selbstacetlylierung von YopP, welche dem Acetyltransfer auf die Kinase vorausgeht, hochgradig beschleunigt. Die Acetylierung der Kinase folgt nicht einem Michaelis-Menten Mechanismus, stattdessen legen die Ergebnisse nahe, dass es sich um einen komplizierteren Mehrsubstratmechanismus handelt. Darüber hinaus deuten die Ergebnisse an, dass die erste und die zweite Acetlylierung der Kinase durch YopP mit unterschiedlichen Reaktionsgeschwindigkeiten erflogen und zuerst eine vollständige Monoacetylierung von YopP erfolgen muss, bevor die Acetylierung des zweiten Serins erfolgt. Die physiologische Bedeutung und Aktivität einer monoacetylierten Kinase muss sich in der Zukunft erweisen.
Rv2140c
Das Protein Rv2140c von Mycobacterium tuberculosis erscheint in Bakterien, die von Immunzellen aufgenommen wurden hochreguliert. Eine Kristallstruktur von Rv2140c legt nahe, dass Rv2140c ein Phosphatidylethanolamin (PE) bindendes Protein sein könnte und NMR Bindungsstudien deuten darauf hin, das Rv2140c mit Locostatin, einem Zellmigrationsinhibitor wechselwirkt. In ITC Bindungsstudien von Rv2140c mit einer Reihe von PE Analogen wurde gezeigt, dass Rv2140c diese mit einer geringen mM Affinität binden kann und somit bestätigt, dass Rv2140c ein PE bindendes Protein ist. Um die Bedeutung von Rv2140c besser zu verstehen, wurde eine Deletion des homologen Gens MSMEG_4199 des verwandten Mycobacterium smegmatis durchgefürt. Dabei zeigte sich, dass das Wachstum von M. smegmatis unter den getesteten Bedingungen nicht von der Deletion von MSMEG_4199 beeinträchtigt wird und das bei Zugabe von Locostatin das Wachstum des Wildtyps und der Deletionsmutanten in gleicher Weise beeinträchtigt sind. Das deutet darauf hin, dass der Effekt von Locostatin auf MSMEG_4199 durch andere Effekte von Locostatin auf M. Smegmatis überdeckt sein könnte.

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