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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-65155
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2013/6515/


Untersuchungen zur Interaktion und subzellulären Lokalisierung der neuronalen Proteine Synaptopodin und AIDA-1

Caumanns, Jana

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Synaptopodin , AIDA , Neuron , synaptische Plastizität
Basisklassifikation: 44.43
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Mohr, Evita (PD Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 03.12.2013
Erstellungsjahr: 2013
Publikationsdatum: 11.12.2013
Kurzfassung auf Deutsch: Das Protein Synaptopodin ist in Podocyten der Niere sowie in Neuronen des Neocortex, Hippocampus, Striatum und Bulbus olfactorius zu finden. In Nervenzellen ist es nahezu ausschließlich in dendritischen Dornen und im Initialsegment der Axone lokalisiert, und es ist maßgeblich an der Ausbildung des Spine-Apparates, einer spezialisierten Form des glatten endoplasmatischen Retikulums, beteiligt. Seine Funktion in Nervenzellen ist jedoch bis heute unzureichend verstanden. Die Kenntnis der Integration von Synaptopodin in ein Netzwerk von Proteinen bietet die Möglichkeit, über seine Funktion zu spekulieren und mit Hilfe geeigneter experimenteller Ansätze zu charakterisieren. Ausgangspunkt für die vorliegende Arbeit war die mit Hilfe der YTH-Technik gefundene Interaktion von Synaptopodin mit einer bisher nicht beschriebenen Spleißvariante des Proteins AIDA-1, die die Arbeitsgruppe als AIDA-1-39.1 bezeichnete (B. Meyer-Hiemer, Institut für Neuroanatomie, Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf, AG Mohr, Dissertation in Vorbereitung). AIDA-1, von dem zahlreiche Speißvarianten beschrieben sind, wird in Neuronen exprimiert und ist unter anderem möglicherweise an der Signalweiterleitung von der Synapse in den Zellkern beteiligt. In dieser Arbeit konnte die Interaktion von Synaptopodin mit AIDA-1-39.1 in Hefezellen bestätigt werden. Darüber hinaus wurden innerhalb des Synaptopodin-Moleküls die mit AIDA-1-39.1 interagieren Bereiche durch umfangreiche Experimente unter Verwendung des YTH-Systems näher eingegrenzt. Anschließende immuncytochemische Analysen mit HEK-293- und COS-7 Zellen zeigten, zumindest in einigen Fällen, eine Kolokalisation der beiden Proteine im Cytoplasma. Auch in primär kultivierten hippocampalen Neuronen der Ratte wiesen einige der dendritischen Dornen sowohl AIDA-1-39.1- als auch Synaptopodin-Immunreaktivität auf. Durch Western Blot-Analysen konnte zudem gezeigt werden, dass beide Proteine Bestandteil biochemisch gereinigter Präparationen der PSD waren. Zur weiteren Analyse der Interaktion wurden Ko-Immunpräzipitationen mit Proteinlysaten von HEK-293 Zellen nach Transfektion mit Synaptopodin- und AIDA-1-39.1 Expressionsvektoren durchgeführt. In Western Blot-Analysen konnte die Interaktion beider Proteine nicht nachgewiesen werden. Dies lässt darauf schließen, dass die Interaktion entweder sehr schwacher oder transienter Natur ist. Es ist ebenfalls nicht auszuschließen, dass die in Hefezellen bestätigte Assoziation beider Proteine in Säugerzellen nicht stattfindet. Die Frage, ob Synaptopodin gemeinsam mit AIDA-1 an Signalvorgängen von der Synapse zum Zellkern beteiligt ist, bleibt daher offen.
Da über die subzelluläre Verteilung der neuen Isoform AIDA-1-39.1 in Nervenzellen keinerlei Daten vorlagen, wurde dies anschließend mit Hilfe immuncytochemischer Verfahren näher untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass AIDA-1-39.1 sowohl im Zellkern sowie punktuell in Dendriten und dendritischen Dornen hippocampaler Neurone lokalisiert ist. Als maßgeblich für die Lokalisierung des Proteins in dendritischen Dornen erwies sich ein PDZ-Bindungsmotiv am C-terminalen Ende des Proteins.
Abschließend wurde in kultivierten hippocampalen Neuronen untersucht, welche Bereiche der kurzen Variante von Synaptopodin, die vorwiegend im Zentralnervensystem exprimiert wird, für den Transport in dendritische Dornen (oder die Verankerung am Ort der Funktion) verantwortlich sind. Dazu wurden Vektoren, die für Teilsequenzen des Proteins kodieren, zur Expression gebracht. Auf diese Weise wurden zwei Abschnitte im C-terminalen Bereich von Synaptopodin identifiziert, die unabhängig voneinander den Transport der rekombinanten Proteine in dendritische Dornen vermitteln.
Kurzfassung auf Englisch: Synaptopodin is a protein which is located in renal podocytes and neurons of the Neocortex, Hippocampus, Striatum und Bulbus olfactorius. Here, it is almost exclusively located in dendritic spines and in the initial axon segment and it is closely linked to the spine apparatus. AIDA-1 as well is a protein expressed in neurons which might be involved in the communication between synapse and nucleus. Both proteins are very likely to play a role for synaptic plasticity, yet their exact functions are still mostly unknown. The starting point of this work was the identification of a novel AIDA-1-Isoform, AIDA-1-39.1( Björn Meyer-Hiemer, Department of Neuroanatomy, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, unpublished data). The protein was identified as an interaction partner of synaptopodin short in a yeast-two-hybrid-screen performed by Björn Meyer-Hiemer.
For there is no data concerning the subcellular localisation of AIDA-1-39.1, immunochemistry was performed with transfected hippocampal neurons of he rat. It was shown that AIDA-1.39.1 is located in the nucleus as well as punctual in dendritic spines. It was also shown that The C-terminal PDZ-binding-motive seems to be essential for the location in dendritic spines.
In order to characterize the targeting sequences in synaptopodin short which mediate the protein’s transport to the dendritic spine, vectors coding for subsequences of the protein were expressed in hippocampal neurons. It was shown that there are two sequences in the C-terminal region oft he protein, which mediate the dendritic location oft he protein.
In addition to that, co-localisation of he proteins in the cytoplasma of the transfected eucaryotic cell lines HEK-293 and COS-7 was shown by performing immunochemistry. In hippocampal neurons co-localisation was shown in dendritic spines. Furthermore, western blot analyses were performed to show that both proteins are part of biochemically purified preparations of he post synaptic density.
To further analyse the shown interaction between synaptopodin and AIDA-1-39.1, the yeast-two-hybrid-system was used. Two sequences in the synaptopodin-protein which interact with AIDA-1-39.1 independently where characterized.
In order to verify the interaction of synaptopodin and AIDA-1.39.1 detected in the YTH-system, the proteins werde expressed in HEK-cells and co-immunoprecipitation was performed. In these experiments, no interaction between the two proteins could be detected. The reason for these negativ results could be a transient or weak interaction of synaptopodin and AIDA-1-39.1. Otherwise , it is also possible that the results in the YTH-system are false-positive and there is no interaction between synaptopodin and AIDA-1-39.1 in vivo. So the question if the interaction of snaptopodin and AIDA-1-39.1 does exist and might play a role for synaptic plasticity, still remains.

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