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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-65370
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2013/6537/


Metagenomische und physiologische Analysen der Interaktion zwischen Mikroalgen und Bakterien in Photobioreaktoren

Krohn-Molt, Ines

Originalveröffentlichung: (2013) Krohn-Molt et al. (2013). \\\"Metagenome survey of a multispecies and alga-associated biofilm revealed key elements of bacterial-algal interactions in photobioreactors.\\\" Appl. Environ. Microbiol. 79(20):6196-206.
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SWD-Schlagwörter: Mikroalgen, Bakterien , Biofilm , Photobioreaktor
Basisklassifikation: 42.30
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Streit, Wolfgang (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 22.11.2013
Erstellungsjahr: 2013
Publikationsdatum: 18.12.2013
Kurzfassung auf Deutsch: Photobioreaktoren (PBRs) stellen eine wichtige Form der Sonnenlicht-abhängigen CO2 - Fixierung im technischen Maßstab dar. Ein Hauptproblem dabei ist, dass es in nicht-axenischen Kulturen durch Bakterien, welche in der Regel mit den Mikroalgen assoziiert sind, zur Bildung lichtundurchlässiger Biofilme kommt und somit die Produktivität der Mikroalgen stark beeinträchtigt wird.
In der vorliegenden Studie wurde erstmalig die zeitabhängige Biofilmentwicklung und die Veränderung der Zusammensetzung der bakteriellen Populationen der Mikroalgen Scenedes-mus obliquus und Chlorella vulgaris in einem Modellreaktor im Detail untersucht. Die bio-chemischen und chemischen Komponenten der Biofilmmatrix setzten sich hauptsächlich aus neutralen und sauren Polysacchariden (11,60 mg/g Biofilm), Fett-säuren (10,40 mg/g Biofilm), Proteinen (3,77 mg/g Biofilm), Uronsäuren (0,82 mg/g Biofilm) und sehr geringe Mengen an DNA (< 4 ng/mg Biofilm) zusammen. Die Populationsdynamik der bakteriellen Gemeinschaft wurde mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) und Untersuchungen der 16S rRNA-Gensequenzen analysiert. Insgesamt ist die Vielfalt mit ca. 30 zugeordneten Bakterienarten eher limitiert. Die Mehrheit dieser Mikroorganismen wurde zu Vertretern der Alpha- und Betaproteobacteria sowie den Bacteroidetes zugeordnet.
Durch einen kombinierten Ansatz der Sequenzierung über \"GS FLX Titanium von Roche\" und \"HiSeq 2000 von Illumina\" konnte ein Datensatz von 350 Mbp assemblierter DNA generiert werden. Die Auswertung dieser Daten deutete auf eine hohe meta-bolische Vielfalt hin. Innerhalb des Metagenoms waren viele Stoffwechselwege und Gene vorhanden, welche Sequenzhomologien für die Verwertung von Polymeren sowie aromatischen und nicht-aromatischen Verbindungen zeigten. Interessanterweise wurde zudem eine relativ hohe Anzahl von Genen identifiziert, welche für Esterasen und Lipasen kodierten. Darüber hinaus konnten Sequenzhomologien zu Genen ermittelt werden, die für die Biosynthese von B-Vitaminen relevant sind. Da Mikroalgen selbst zumeist keine B-Vitamine (Cobalamin, Thiamin und z.T. Biotin) synthetisieren können, implizieren diese Ergebnisse, dass die meta-bolischen Leistungen der bakteriellen Populationen unerlässlich für das Wachstum und die Stabilität der Algenkultur sind. Sie deuten aber auch daraufhin, dass die Bakterien die von den Algen produzierten und freigesetzten Exsudate verstoffwechseln können.
Im Zuge einer weiteren Charakterisierung des Biofilmmetagenoms wurde aus der isolierten DNA eine 14.976 Klone umfassende Fosmidbank konstruiert. Die durchschnittliche Insertgröße betrug 30-35 kb, welches ca. 524 Mbp an klonierter DNA entspricht. Durch funktionelle Testverfahren konnten erste Einblicke in die Enzym-aktivität der in dem Photo-bioreaktor vorkommenden Bakterien gewonnen werden. So wurden 68 putativ positive Klone gefunden, die Esterase/Lipase - Aktivität zeigten. Die Zellrohextrakte von 16 dieser Fosmid-klone bestätigten, dass eine breite Palette von Fettsäuren mit unterschiedlicher Kettenlänge verstoffwechselt werden kann.
Kultivierungsabhängige Untersuchungen bestätigten diese Ergebnisse. So konnte direkt in zellfreien Überständen der Mikroalgenkultur Esterase/Lipase - Aktivität sowie die B-Vitamine Cobalamin (B12) und Biotin (B7) nachgewiesen werden. Parallel hierzu wurden auch Untersuchungen zur Kultivierung und Isolierung einzelner Bakterienarten aus dem Mikroalgen-Bakterien-Konsortium durchgeführt. Anfängliche Versuche resultierten in der Iso-lierung von zwei Reinkulturen. Erst nach Zugabe von 5 50% (v/v) der Mikroalgenkultur konnten sechs weitere Bakterienarten isoliert werden.
Vor dem Hintergrund, dass Biofilme die Photosyntheseaktivität und somit die Produktivität der Mikroalgenkultur negativ beeinflussen, wurden im Laufe dieser Arbeit zwei Screening-methoden entwickelt, die zur Identifizierung von Biofilm-inhibierenden Syntheseprodukten aus Metagenombanken führen sollten. Insgesamt konnten 10 aktive Fosmidklone ermittelt werden, deren Zellrohextrakte eine inhibierende Wirkung auf die Biofilmbildung von Gram-positiven und -negativen Bakterien zeigten.

Somit konnte im Rahmen dieser Arbeit eine umfassende Charakterisierung der phylo-genetischen Zusammensetzung sowie des metagenomischen und physiologischen Potentials von Algen-assoziierten Bakterien erarbeitet werden. Zudem wurde deutlich, dass es sich bei der Interaktion der Bakterien mit den Algen um eine sehr fein abgestimmte Biozönose handelt, wobei die Bakteriengemeinschaft die Mikroalgen mit essentiellen B-Vitaminen versorgt und im Gegenzug die Mikroalgen den heterotrophen Bakterien komplexe Kohlen-stoffverbindungen zur Verfügung stellten.
Kurzfassung auf Englisch: Photobioreactors (PBRs) are an important form of sunlightdependent CO2 - fixation on an industrial scale. One major problem is that bacteria in non-axenic cultures, which are usually associated with microalgae, form opaque biofilms and thereby affect the productivity of the microalgae significantly.
In the present study time-dependent biofilm development and changes in the composition of bacterial population of the micro-algae Scenedesmus obliquus and Chlorella vulgaris in a modelreactor were analysed in detail for the first time. The biochemical and chemical compo-nents of the biofilm matrix consisted mainly of neutral and acidic polysaccharides (11.60 mg/g biofilm), fatty acids (10.40 mg/g biofilm), proteins (3.77 mg/g biofilm), uronic acids (0.82 mg/g biofilm) and only traces of DNA (< 4 ng/mg biofilm). The population dynamics of the bacterial community was determined by scanning electron microscopy (SEM) and sequencing of the 16S rRNA genes. In general, the diversity was rather limited with approxi-mately 30 bacterial species. The majority of these microorganisms have been assigned to representatives of Alpha-, and Betaproteobacteria and Bacteriodetes.
Through a combined approach of sequencing by \"GS FLX Titanium Roche\" and \"HiSeq 2000 from Illumina\" resulted in the overall production of 350 Mbp of sequenced DNA. The analysis of these data indicated a high metabolic diversity. Within the metagenome, many metabolic pathways and genes were present, which showed sequence homologies for the utilization of polymers and aromatic and non-aromatic compounds. Interestingly, also a relatively large number of genes have been identified which encode for esterases and lipases. In addition, sequence homologies to genes could be detected, which are relevant for the bio-synthesis of B vitamins. Since most microalgae cannot synthesize B vitamins (cobalamin, thiamine and biotin in some cases), these results imply that the metabolic activities of bacterial populations are essential for the growth and stability of algal culture. But they also suggest that the bacteria can metabolize the exudates produced and released by the algae.
In order to further characterize the biofilm metagenome, a comprehensive fosmid metagenome library comprising 14,976 clones was constructed from the isolated DNA. The average insert size was 30-35 kb., which corresponds to approximately 524 Mbp of cloned DNA. Through functional screening procedures, insights into enzyme activity of the bacteria occurring in the photo-bioreactor were gained. Through this, 68 clones that were assumed to be positive were found to show esterase/lipase activities. The crude cell extract of 16 of these fosmid clones confirmed that a wide range of fatty acids of different chain lengths can be metabolized.
Cultivation-dependent analysis confirmed these results. Esterase/lipase activity, as well as the B-vitamins cobalamin (B12) and biotin (B7) could be detected directly in cell-free superna-tants of microalgae culture. In parallel, studies of cultivation and isolation of individual bacte-rial species from the microalgae-bacteria-consortium were performed. Initial attempts resulted in the isolation of two pure cultures. Only a addition of 5-50% (v/v) of the micro-algae cul-ture, growth of another six bacterial organisms was stimulated.
In consideration that biofilms negatively affect the photosynthetic activity and thus the productivity of microalgae culture, two screening methods were developed in this study, which should lead to the identification of biofilm-inhibiting synthesis products from meta-genomic libraries. A total of 10 active fosmid clones were identified, whose crude cell extract showed an inhibitory effect on biofilm formation of Gram - positive and - negative bacteria.

Thus, a comprehensive characterization of the phylogenetic composition of the metagenomic and physiological potential of algae-associated bacteria could be developed within the frame-work of this study. It was also apparent that the interaction between bacteria and algae is a very finely balanced biological biocenosis, in which the bacterial community supplies the micro-algae with essential B-vitamins, and the microalgae in turn supplied the heterotrophic bacteria with complex carbon compounds.

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