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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-65522
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2014/6552/


Funktionelle Analyse dendritischer mRNA-Bindeproteine und ihre Bedeutung für die postsynaptische Dichte exzitatorischer Synapsen

Bamann, Margarete

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Postsynaptische Dichte , exzitatorische Synapse , RNA-Bindeproteine , dendritisch , Lentivirus
Freie Schlagwörter (Englisch): Postsynaptic density , excitatory synapse , RNA-binding protein , dendritic , lentivirus
Basisklassifikation: 42.15 , 42.13 , 42.84
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Kreienkamp, Hans-Jürgen (PD Dr. )
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 29.11.2013
Erstellungsjahr: 2013
Publikationsdatum: 13.01.2014
Kurzfassung auf Deutsch: An exzitatorischen Synapsen kann die Reizweiterleitung moduliert werden. Diese Modulation ist wahrscheinlich die Grundlage von Lernprozessen und Gedächtnisbildung bei Säugern und wird synaptische Plastizität genannt. Der Umbau der postsynaptischen Dichte (PSD) auf einen einkommenden Reiz hin trägt wesentlich zur synaptischen Plastizität bei. Dafür werden an einzelnen Synapsen spezifische Proteine benötigt. Gewährleistet wird dies unter anderem durch dendritisch lokalisierte Transkripte, die an der Synapse reizabhängig translatiert werden können. So sind sowohl die Shank1- als auch die Shank3-mRNA im Hippocampus dendritisch lokalisiert. Der Transport von mRNAs in die Dendriten erfolgt in messenger Ribonukleopartikeln (mRNPs), die mit Hilfe von Motorproteinen wie z.B. KIF5c entlang des Zytoskeletts in die Dendriten gelangen. In dieser Arbeit wurden die mRNA-Bindeproteine (RBPs) Purɑ, Staufen1, Staufen2 und DDX1, die in einem KIF5c-assoziierten mRNP (KIF5c-mRNP) identifiziert wurden, durch die Untersuchung von assoziierten mRNAs und durch lentivirale Knockdown-Experimente funktionell analysiert.
Zunächst wurden RFP-markierte Varianten der RBPs in Neuronen exprimiert und anschließend immunpräzipitiert. Eine nachfolgende Analyse der assoziierten mRNAs durch reverse Transkriptase quantitative real-time PCRs zeigte, dass insbesondere die Shank2-mRNA mit dem Protein Purɑ assoziiert war. Weiterhin waren mehrere der Shank-mRNAs, aber auch nicht dendritisch lokalisierte Kontroll-mRNAs mit den bei- den Staufen-Proteinen assoziiert.
Ein effizienter lentiviraler Knockdown konnte sowohl für Staufen2 als auch für DDX1 in kultivierten Neuronen etabliert werden. Eine quantitative Analyse von Schlüsselproteinen der PSD zeigte sowohl nach Knockdown von Staufen2 als auch von DDX1 eine Verringerung dieser Proteine. Dies betraf sowohl die Untereinheiten der ionotropen Glutamatrezeptoren GluR1 und NR1 als auch das Gerüstprotein Shank1. Der Knockdown von Staufen2 verringerte zusätzlich die MAP-Kinase ERK1/2, erhöhte aber die Konzentration des Proteins IRSp53. Außerdem hatte der Knockdown von DDX1 zusätzlich negativen Einfluss auf die Mengen der Proteine Shank3 und mGluR5. Die Analyse der Expression von Transkripten, die für einige dieser Proteine kodieren, zeigte, dass die Mengen fast aller untersuchten mRNAs nach dem Knockdown von Staufen2 erhöht waren. Dies bestätigte eine Rolle der Staufen-Proteine beim Abbau von mRNAs im Rahmen des staufen1-mediated decay, ein Abbauweg für mRNAs. Der Knockdown von DDX1 führte zu leichten Veränderungen der mRNA-Mengen, die jedoch nicht in dem Maße reduziert waren wie die Proteinmengen. Beide RBPs werden demnach für eine effiziente Translation der mRNAs benötigt.
Der Knockdown von Staufen2 oder DDX1 führte außerdem zu Veränderungen von Komponenten des KIF5c-mRNPs. Der Knockdown von Staufen2 reduzierte die Proteinmenge von FMRP und erhöhte die von DDX1. Die Expression der DDX1-mRNA war durch den Staufen2-Knockdown ebenso erhöht. Der Knockdown von DDX1 wiederum verringerte nur die Menge des Proteins Staufen2, wohingegen die Expression der entsprechenden mRNA unverändert blieb. Die Veränderungen der Proteine des KIF5c-mRNPs könnten die Struktur des mRNPs stören oder auflösen und den ähnlichen Effekt auf die PSD-Proteine durch den Knockdown von Staufen2 oder DDX1 erklären. Die Kontrolle der Translation, Stabilität und wahrscheinlich auch der Lokalisation der für die synaptischen Proteine kodierenden mRNAs durch mRNPs hat demnach eine zentrale Bedeutung für die korrekte Bildung der postsynaptischen Dichte. Darüber hinaus wurden in dieser Arbeit drei Punktmutationen im SHANK3-Gen funktionell analysiert, die in von Autismus betroffenen Patienten identifiziert wurden. Nach Expression der Shank3-Varianten in kultivierten hippocampalen Neuronen zeigten diese im Vergleich mit dem Wildtyp keine Unterschiede in Anzahl und Form der dendritischen Dornen oder in der Lokalisation des Proteins. Die autistischen Symptome werden also nicht durch eine fehlerhafte synaptische Lokalisierung des Proteins an Synapsen oder durch fehlerhafte Ausbildung der neuronalen Morphologie hervorgerufen.
Kurzfassung auf Englisch: Synaptic transmission at excitatory synapses can be modulated. Such modification which is called synaptic plasticity contributes substantially to learning processes and memory of mammals. The change of the protein-composition of the postsynaptic density (PSD) due to an incoming signal contributes to synaptic plasticity. The reorganization of the stucture of the PSD needs specific proteins at selected synapses. One mechanism to ensured this is the dendritic localization of mRNAs and local protein synthesis. The mRNA coding for Shank1 and Shank3 are localized in dendrites of hippocampal neurons. The transport of transcripts to dendrites is mediated by messenger ribonucleoparticles (mRNPs), which are associated with motor proteins, such as KIF5c, along the cytoskeleton. Here, the mRNA-binding proteins (RBPs) Purɑ, Staufen1, Staufen2 and DDX1, which were all identified in a KIF5c-associated mRNP (KIF5c-mRNP), were functionally analyzed by the examination of associated mRNAs and by lentiviral knockdown experiments.
Initially, RFP-tagged versions of the RBPs were expressed in neurons and immunoprecipitated afterwards. The subsequent analysis of associated mRNAs by reverse trancriptase quantitative real-time PCR revealed an interaction between Purɑ and the Shank2-mRNA. Furthermore, several Shank transcripts (but also not dendritic localized control-mRNAs) were associated with the two Staufen proteins.
An efficient lentiviral knockdown of Staufen2 and DDX1 could be established in primary neurons. A quantitative analysis of key proteins of the PSD showed a reduction of these proteins after knockdown of Staufen2 or DDX1. This affected the subunits of ionotropic glutamatereceptor GluR1 and NR1 as well as the scaffold protein Shank1. The knockdown of Staufen2 additionally decreased the MAP-kinase ERK1/2 but increased the concentration of IRSp53. Moreover, the DDX1-knockdown had a negative impact on Shank3 and mGluR5. The quantitative analysis of transcripts, which encode some of these proteins, revealed that after Staufen2-knockdown almost all examined mRNA- levels were increased. This confirms a role of Staufen-proteins in the Staufen1-mediated decay, a posttranscriptional regulatory mechanism that degrades mRNAs. Despite slight changes of mRNA-levels after DDX1-knockdown, these were not as strongly reduced as the encoded proteins. Therefore, both proteins are essential for efficient translation of these mRNAs.
Furthermore, the knockdown of Staufen2 or DDX1 entailed alterations of proteins, which are components of the KIF5c-mRNP. The knockdown of Staufen2 decreased the concentration of the protein FMRP and increased the DDX1 level. The expression of DDX1- mRNA was also increased due to the Staufen2-knockdown. In contrast, the knockdown of DDX1 reduced only the protein Staufen2, whereas the corresponding mRNA-level was unaltered. The changed concentrations of the analyzed proteins could result in a defective or dissolved structure of the mRNP and could explain that knockdown of both proteins had similar effects on proteins of the PSD. Thus, the control of translation, stability and probably also of localization of mRNAs by mRNPs is the central importance for appropriate PSD-formation.
Moreover, in this thesis the functional relevance of three point mutations in the SHANK3 gene were analyzed. All mutations are associated with autism spectrum disorders. However, neither the number or shape of spines nor the localization of the proteins were affected by one of the mutations after the expression of the different Shank3-versions in cultured hippocampal neurons. Therefore, the symptoms of the patients are not due to altered localization of the Shank3-protein at synapses or due to incorrect development of spines.

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