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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-65712
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2014/6571/


Designed Enzyme-Inorganic Hybrid Materials for Applications in Biocatalysis

Maßgeschneiderte anorganische Biohybridmaterialien für Anwendungen in der Biokatalyse

Fried, Dorothee Irmgard

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SWD-Schlagwörter: Biokatalyse , Immobilisierung , Siliciumdioxid , Magnetit
Basisklassifikation: 35.17
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Fröba, Michael (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 17.01.2014
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 23.01.2014
Kurzfassung auf Deutsch: Die Anwendung von anorganischen Biohybridmaterialien als Katalysatoren in industriellen Anwendungen stellt eine vielversprechende Methode zur Entwicklung von ökologisch nachhaltigen Prozessen dar. Diese sogenannte Grüne Chemie wird in der Regel aus einer Vielfalt an wichtigen Prozessen gebildet, z.B. der Reduktion von chemischen Abfällen sowie Nebenprodukten. Ein weiterer Kernpunkt ist die Reduktion von Energie, die den Prozessen zugeführt werden muss. Hierbei leisten Enzyme, die in der Regel bei milden Reaktionsbedingungen arbeiten, einen wichtigen Beitrag. Aber auch ihre hohe katalytische Effizienz ist ein weiterer großer Vorteil der Biokatalysatoren. Diesen Vorteilen stehen jedoch auch einige Nachteile gegenüber wie z.B. die problematische Abtrennung von Enzymen aus Reaktionsgemischen oder ihre geringe Stabilität bei bestimmten Reaktionsbedingungen (z.B. hohe Temperatur). Die Immobilisierung der Enzyme kann hier entgegenwirken und einen entscheidenden Beitrag zur effizienten industriellen Nutzung von Enzymen in der Biokatalyse leisten.
Einhergehend mit der Weiterentwicklung der Enzyme für biokatalytische Anwendungen wurde im letzten Jahrzehnt viel an den jeweiligen Trägermaterialien geforscht. Ziel dieser Arbeit war es Materialien entsprechend der Eigenschaften der Enzyme zu gestalten und somit eine effiziente Stabilisierung und biokatalytische Leistung zu erzielen. Hierbei wurden zwei verschiedene Themenbereiche bearbeitet.

Im ersten Teil der Dissertation wurden nanoporöse Materialien als Träger für Glucose-6-phosphat Dehydrogenase (G6PDH) verwendet um einen stabilen Biokatalysator für den Einsatz als Cofaktorregenerator in Enzymkaskaden zu erhalten. Hierbei wurden verschiedene nanoporöse Trägermaterialien auf Basis von Kohlenstoff und Silica eingesetzt. Die Oberfläche der Trägermaterialien sowie deren Porosität wurden den Eigenschaften des Enzyms entsprechend modifiziert und ihre Eigenschaften intensiv untersucht. Einer der Kernpunkte beim Beginn der Immobilisierungsversuche war der große hydrodynamische Durchmesser (> 13 nm) des Enzyms, der die Auswahl der porösen Träger bestimmte.
Anfangs wurde eine grobe Einschränkung der möglichen Trägermaterialien durchgeführt bei der hierarchische Kohlenstoffe sowie mesostrukturierte Silicaschäume mit unterschiedlicher organischer Funktionalisierung verwendet wurden. Die Makroporen der Kohlenstoffträger (> 300 nm) wurden als Wirtstruktur für G6PDH verwendet unter der Annahme, dass die Diffusion durch die großen Poren nicht gehindert wird. Leider führte die Hydrophobizität der Kohlenstoffe zu niedriger Aufnahme an Enzym sowohl als auch zu schlechter biokatalytischer Leistung. Die MCF Materialien wurden postsynthetisch mit unterschiedlichen Organosilanen funktionalisiert um eine Vielfalt an Wechselwirkungen mit dem Enzym zu erzielen. Bei der Adsorption der Enzyme wurde festgestellt, dass Coulomb-Kräfte die Triebkraft der Immobilisierung darstellten. Bei negativ geladenen Trägern wurden daher beim pH Wert der Immobilisierung (pH 7.4) durch die Abstoßung mit dem überwiegend negativ geladenen Enzym (pI 4.6) niedrige Aufnahmekapazitäten erhalten, wohingegen positiv geladenes 3-Aminopropyl-funktionalisierte MCF das gesamte Protein aus der Lösung aufnahm. Aber nicht nur die Aufnahme des Enzyms aus der Lösung war überdurchschnittlich hoch, sondern auch der Aktivitätserhalt (90 %) sowie die Stabilität waren den anderen Biokatalysatoren weit überlegen.
Auf Grund der aussichtsreichen Resultate der Experimente wurde der Fokus auf die Immobilisierung der G6PDH im Folgenden auf Amin-funktionalisierte Materialien gerichtet. Hierfür wurden MCF Trägermaterialien mit Aminosilanen unterschiedlicher Kettenlänge (C3, C7, C11) modifiziert und in der Immobilisierung eingesetzt. Es wurde festgestellt, dass die zunehmende Kettenlänge eine starke Hydrophobizität der Materialien herbeiführte, die zu einer Reduktion der Aufnahme, der Stabilität und Aktivität führte. Die Zugabe von DMSO zur Erhöhung der Hydrophobizität des Puffers führt zwar zur besseren Benetzung des Materials und somit zu Erhöhung der Proteinaufnahme, jedoch auch zur Inhibierung des Enzyms.
Des Weiteren wurden periodische mesoporöse Organosilica (PMO) als mögliche Träger untersucht. Da sich bei diesen Materialien die organische Gruppe, in diesem Fall sekundäre und tertiäre amin-verbrückte Silane, in der Wand des Materials befinden und nicht in die Poren hineinragen, wurden die Unterschiede zu MCFs, die mit primären, sekundären und tertiären kurzkettigen Aminosilanen (C3) funktionalisiert waren, als Träger getestet. Auf Grund der Ähnlichkeit der Oberflächen der PMOs stellte sich heraus, dass Unterschiede in der biokatalytische Performance sowie der Proteinaufnahme nur mit der Porengröße der PMOs korrelierte. Das PMO mit der geringsten Porengröße, in diesem Fall synthetisiert auf der Basis eines tertiären amin-verbrückten Präkursoren, wies die höchste Enzymstabilität auf, da das Protein durch die enge Umschließung der Poren stabilisiert wurde. Im Gegensatz hierzu wurde von einem Aerogel-PMO die höchste Menge an Enzym aufgenommen, da die großen Poren eine ungehinderte Diffusion in das Material erlaubten. Da die jeweiligen MCF Referenzmaterialien keine Unterschiede in ihren Porengrößen aufwiesen, konnten keine signifikanten Unterschiede in ihrer Aktivität, Proteinaufnahme sowie Stabilität nachgewiesen werden.
G6PDH adsorbiert auf 3-Aminopropyl-modifiziertem MCF stellte sich in den vorhergehenden Experimenten als bestes Trägermaterial für die Immobilisierung von G6PDH heraus und wurde daher für die Erstellung einer zwei-Enzym Sequenz mit immobilisierter 6 Phosphogluconat Dehydrogenase verwendet. In dieser Sequenz wurde erfolgreich Glucose-6-phosphat zu Ribulose-5-phosphat unter Umsetzung von NADP+ zu NADPH umgewandelt.
Die Resultate dieser Testreihen belegen eindeutig die Stabilisierung des eingesetzten Enzyms und somit auch den Einsatz maßgeschneiderter Materialien als Träger für die Biokatalyse. Der Einsatz in einer zwei-Enzym Sequenz unterstreicht die mögliche Anwendung des Enzyms im Hinblick auf die Cofaktor-Regeneration in Enzymkaskaden.

Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit dem Aufbau eines Designer-Cellulosoms auf anorganischen sphärischen Partikeln. Cellulosome sind Proteinkomplexe, die in der Natur effizient Cellulose zu Glukose zerlegen und somit für die Synthese von Biokraftstoffen sowie die Synthese von Basischemikalien in der Zukunft von Bedeutung sind.
Der Aufbau des Cellulosoms aus seinen Komponenten wurde in drei Schritten durchgeführt: Zuerst wurden Silicapartikel nach der Stöbermethode synthetisiert und mit Organosilanen funktionalisiert. Die Silicapartikel fungierten in diesem Fall als Modellsystem um die Kupplungsreaktionen zu optimieren und in Zukunft auf mit Silica beschichtete Magnetitpartikel zu übertragen. Der zweite Schritt befasste sich mit der kovalenten Anbindung der Cohesin und CBM Einheiten des Cellulosoms. Hierbei wurden zwei verschiedene Kupplungsreaktionen angewandt: Ein Click-Chemie Ansatz, der sich mit der Anbindung von Acetylen-funktionalisierten Proteinen an azidfunktionalisierte Silicapartikel beschäftigte. Diese Methode erforderte die Modifizierung der Cohesin-CBM Einheit mit 4-Pentinsäure an den jeweiligen Lysinen der Proteine. Die Aktivierung der 4-Pentinsäure erfolgte mit EDC vor der Anbindung an das Protein. Das modifizierte Protein wurde anschließend über eine 1,3-dipolare Cycloaddition unter Cu(I)-Katalyse an die Silicapartikel gebunden. Die zweite konventionelle Biokonjugationsmethode, die Aktivestersynthese, ermöglichte die direkte Anbindung des Proteins ohne vorherige Modifizierung. Hierfür wurden in einer 2-stufigen Syntheseroute zuerst Carbonsäure-modifizierte Partikel mit EDC/NHS aktiviert und im nächsten Schritt mit den Proteinen umgesetzt. Der Click-Chemie Ansatz erzielte in der Anbindung der Cohesin-CBM Einheit höhere Kupplungsausbeuten mit 19 µg mg-1 (4x10-4 µmol g-1). Im letzten Schritt wurde die katalytische Einheit (Cellulase) mit Hilfe der spezifischen Cohesin-Dockerin Wechselwirkung angebunden. Die ersten Aktivitätstests des erhaltenen immobilisierten Cellulosoms zeigten, dass der erhaltene Biokatalysator die Zersetzung von Carboxymethylcellulose erfolgreich durchführte. Jedoch muss die Quantifizierung er Aktivität sowohl als auch ein Vergleich mit immobilisierter Cellulase ohne Cohesin und CBM Einheit noch erfolgen.
Für den zukünftigen Transfer der Kupplungsprozesse auf Silica beschichtete Magnetitpartikel wurden die Bedingungen für die Beschichtung optimiert. Die einmalige Zugabe von TEOS stellt sich in den Versuchen als bessere Methode heraus im Vergleich zur Zugabe von mehreren Aliquots TEOS. Die mit der ersten Methode erhaltenen Partikel wiesen wenig Agglomeration und keine Bildung von kleinen Silicapartikeln auf, stattdessen wurden spherische Partikel mit einer geschlossenen Schicht (ca. 50 nm) aus Silica erhalten. Da die ersten Resultate des auf Silicapartikeln zusammengesetzten Cellulosoms sehr vielversprechend waren, sollten sie in Zukunft auf magnetischen Partikeln zur Zersetzung von kristalliner Cellulose angewendet werden.

Zusammenfassend wurden in dieser Dissertation zwei Anwendungsgebiete für Biohybride in der Katalyse erfolgreich durchgeführt. Außerdem wurde die Immobilisierung von Enzymen auf Trägermaterialien als vielversprechender Ansatz in der Biokatalyse bestätigt.
Kurzfassung auf Englisch: The application of inorganic-biohybrids as biocatalysts in industrial approaches is one promising approach to perform environmentally friendly processes. The so-called Green chemistry includes the reduction or elimination of waste, the reduction of energy needed for the processes and a reduction of side-products. But enzymes can add other benefits to the catalytic processes like their high selectivity, activity and mild reaction conditions. To balance the optimum performance with an easy handling of the biocatalyst their attachment to a solid carrier is often required. The immobilization of the enzymes facilitates their recovery and enhances their stability.
In the last decade the use of immobilized enzymes in biocatalysis was not only influenced from advances made in biotechnology but also in materials science. Two approaches were applied here to yield stable and easy separable biocatalysts that can be used for applications in Green chemistry.

Nanoporous materials were used as carrier materials for glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) to yield a stable biocatalyst. G6PDH is a co-factor regenerating enzyme that will be beneficial for the operation of enzyme cascades. A two-enzyme cascade was used to proof the general applicability of this enzyme for applications in cascades. To yield a highly stable and active biocatalyst the porosity and surface characteristics of the nanoporous materials were intensively studied in order to find a material perfectly tailored according to the enzymes´ needs. The size of the pores was a major criterion for the selection of the materials since the enzymes hydrodynamic diameter was supposed to be larger than 13 nm. Various carbon and silica based materials were used as possible support materials. The group of silica materials was divided into periodic mesoporous organosilicas (PMOs) and mesostructured siliceous foams (MCFs).
At first a screening of MCFs and carbon materials with different properties was performed in order to locate possible carrier materials for the adsorption of G6PDH. The carbon materials exhibited macropores (> 300 nm) that were supposed to host the enzyme without any diffusion limitations during catalysis. Unfortunately, the high hydrophobicity of the carbons led to a low amount of immobilization at pH 7.4 and high leaching of the hydrophilic enzyme as well as poor biocatalytic performance. MCF was grafted with different organic moieties in order to provide different surface charges. The coulomb interactions were found to be the major driving force of the immobilization. Thus negatively charged materials showed low uptake of enzyme due to electrostatic repulsion with the enzyme (pI 4.6) whereas G6PDH immobilized on positively charged 3 aminopropyl-modified MCF exhibited excellent affinity towards the material. Not only the uptake performance was superior to all other used materials but also retention of 90 % of the activity and a high stabilization due to the confinement in the pores was obtained.
Due to the promising results amine-modified porous materials were studied in more detail. The chain length of the amine-containing spacer was increased in order to study the effect of increasing hydrophobicity and mobility of the enzyme. The best results were still obtained for the support modified with the short-chain (C3) whereas the increasing hydrophobicity of C7 and C11 chain length showed poor biocatalytic performance. One reason of the low performance was the low dispersibility of the hydrophobic materials in buffer. Thus DMSO was added to the mixture and indeed a high uptake of enzyme was observed due to the wetting of the material on the external and internal surface. Unfortunately, the enzyme was inhibited by DMSO and the activity dropped significantly.
Secondary and tertiary amine-bridged PMOs were applied as supports in order to use materials with a high content of organic groups as well as to investigate if the position of the organic moiety has an influence on the affinity towards the enzyme. As a comparison MCF materials modified with short-chain primary, secondary and tertiary amines were chosen as supports. Due to similar surface characteristics the uptake and biocatalytic performance of the PMO materials was mainly determined by their differences in their pore size. The PMO synthesized with the tertiary amine precursor exhibited the highest stability since it pores were the smallest and therefore the confinement effect was enhanced. The uptake of enzyme from solution was highest for the aerogel-type PMO since the large pores induced no diffusion limitations. Since no differences in porosity were observed for the MCF materials with primary, secondary an tertiary amines, the biocatalytic performance was not affected. All MCF materials exhibited high uptake, activity and stability. The results showed that the immobilization inside the porous network of the materials was highly beneficial for the biocatalytic performance. Additionally it was proven that the tailoring of porous materials according to the enzyme is a highly useful technique in biocatalysis.
The most promising biocatalyst (G6PDH on MCF-C3-NH2) was combined with immobilized 6PGDH in a two-enzyme sequence for the conversion of glucose-6-phosphate to ribulose-5-phosphate. The general applicability of the biocatalyst in enzyme cascades was proven with these experiments. In the future the construction of enzyme cascades with G6PDH and other enzymes would be one main scope of application for this optimized biocatalyst. Even more likely would be an application with the focus of energy generation or fuel synthesis. For example, a coupling of the two-enzyme sequence with a hydrogenase that produces hydrogen would be a possibility.

The assembly of a designer cellulosome onto inorganic particles built the second part of this dissertation. Cellulosomes are protein complexes that efficiently degrade cellulose into glucose moieties which can be used as educt for biofuels or basis chemicals for chemical industry. The immobilization of the cellulosome was performed in three steps: First, silica particles were synthesized and functionalized with organosilanes. The silica particles were used as a model system to optimize the coupling chemistry and will be replaced by silica coated iron oxide particles. Second, the cohesin-CBM unit of the cellulosome was covalently bound to the particles. Two approaches were used here: The click-chemistry approach between azide-functionalized particles and acetylene-functionalized proteins required a modification of the lysines with 4 pentynoic acid prior to the immobilization. The modification was performed by activation of the 4-pentynoic acid with EDC. The modified protein was then bound covalently onto azide-modified silica particles by 1,3-dipolar cycloaddition catalyzed by Cu(I). The second approach was an active ester approach onto carboxylic acid modified particles. A two-step procedure was performed that consisted of an activation of the particles by EDC/NHS prior to the covalent attachment of the protein. The click-chemistry approach led to the highest obtained yields of 19 µg mg-1 (4x10 4 µmol mg 1). The catalytic active cellulase was attached by the highly specific recombination of the cohesin-dockerin domains. The first activity tests showed that the combined immobilized cellulosome was still active towards the degradation of carboxymethyl cellulose but the quantification of the activity as well as the comparison with immobilized cellulase without cohesin and CBM have still to be done.
For the transfer of the coupling chemistry onto magnetic particles, the coating of magnetite particles was optimized. It was proven that an addition of the TEOS at one time leads to particles of higher quality than the addition in small aliquots. The obtained particles would be optimum supports for the application of immobilized cellulosomes in cellulose degradation. The first results obtained for the assembly and application of a cellulosome were very promising and thus have to be transferred to the application in a mixture with crystalline cellulose.

All in all, the application of biohybrid materials in Green chemistry was achieved by careful tuning of the support characteristics and thus efficient immobilization. In the future the focus of the research will be laid more on the design of complex catalytic processes and the need to construct them not only environmentally but also economically feasible. Here it is important to address major criteria for industrial use that are: costs, flow and diffusion of reaction mixtures as well as mechanical stability of the materials since most of the materials will be used in complex reactor systems. The reduction of the process costs may be achieved in the future when porous materials are used simultaneously as purification device for the proteins that are immobilized since the use of highly purified enzymes is very expensive. Despite all difficulties the use of immobilized enzymes will be one of the key issues in industrial synthesis in the next decades.

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