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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-65873
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2014/6587/


Untersuchungen zur funktionellen Rolle des Prionproteins unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen

Hoffmann, Kathrin

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Basisklassifikation: 42.15
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Schachner Camartin, Melitta (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 22.11.2013
Erstellungsjahr: 2013
Publikationsdatum: 05.02.2014
Kurzfassung auf Deutsch: Die Funktion der physiologischen Form des Prion-Proteins (PrP=Prion related Protein) ist bis heute nicht eindeutig aufgeklärt. Es gibt aber Hinweise, dass PrPC eine Rolle im Schutz vor oxidativem Stress spielt, indem es reaktive Sauerstoffspezies (ROS) erkennt.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte ich mittels einer Ko-Kultur von Neuronen und Astrozyten zeigen, dass Wildtyp-Kleinhirnneuronen bei oxidativem Stress besser auf Wildtyp-Astrozyten überleben als auf PrP-defizienten Astrozyten. Des Weiteren konnte ich nachweisen, dass isolierte Exosomen aus dem Medium von Wildtyp-Astrozyten, welche oxidativem Stress ausgesetzt wurden, nicht aber isolierte Exosomen von unbehandelten Astrozyten oder behandelten PrP-defizienten Astrozyten, das Überleben von Wildtyp-Kleinhirnneuronen erhöhen. Die massenspektrometrische Analyse der Exosomen von Hypoxie behandelten Wildtyp-Astrozyten und PrP-defizienten Astrozyten ergab, dass die Mengen bestimmter exosomaler Proteine bei Wildtyp-Exosomen und PrP-defizienten Exosomen unterschiedlich ist. Mittels Immunoblot konnte bestätigt werden, dass Clusterin (Apolipoprotein J) in Wildtyp-Exosomen vorhanden ist und die Menge an Clusterin nach Hypoxie abnimmt, wohingegen in PrP-defizienten-Exosomen kaum Clusterin nachgewiesen werden konnte. Die Menge an Apolipoprotein E hingegen nimmt bei Wildtyp-Exosomen nach Hypoxie zu und bleibt bei PrP-defizienten-Exosomen gleich. Diese Ergebnisse zeigen, dass PrP nicht nur Einfluss auf die Schutzmechanismen an der Zelle hat, sondern auch eine Rolle spielt bei der Zusammensetzung von Exosomen und so benachbarte Zellen vor oxidativem Stress schützen könnte.
Das Glutathion-System ist der Hauptmechanismus, um Zellen vor ROS und Xenobiotika über einen Redoxmechanismus zu schützen. Ich konnte zeigen, dass die Menge an Glutathion in Gehirnen adulter Wildtyp-Mäuse und PrP-defizienter-Mäuse nicht unterschiedlich ist. Hingegen konnte ich nachweisen, dass in PrP-defizienten-Astrozyten die Menge an reduziertem Glutathion erhöht ist, diese aber durch Hydrogenperoxid (ROS Donor) abnimmt während die Menge an reduziertem Glutathion in Wildtyp-Astrozyten nahezu unverändert bleibt. Im Kulturmedium von PrP-defizienten Astrozyten konnte nach Behandlung mit Hydrogenperoxid eine erhöhte Menge an Glutathion festgestellt werden, nicht aber im Kulturmedium von Wildtyp-Astrozyten. Durch Inhibition des astrozytären Glutathionexports via MDR1 konnte die Erhöhung reduziert werden. wobei das Glutathion-Transportsystem bei PrP-defizienten-Astrozyten empfindlicher auf den Inhibitor reagiert. Dies deutet auf eine Wechselwirkung zwischen PrP und dem Glutathion-Transportsystem hin. Zudem konnte gezeigt werden, dass die -Glutamyltranspeptidase (GGT), welche Glutathion extrazellulär abbaut in PrP-defizienten-Astrozyten, eine verminderte Aktivität zeigt. Zu der Akkumulation von reduziertem Glutathion im Medium PrP-defizienter Astrozyten kann es also durch die geringere Aktivität der GGT kommen.
Durch den verringerten extrazellulären Abbau von Glutathion steht Neuronen weniger Cystein zu Verfügung, diese benötigen Cystein um Glutathion aufzubauen, da es in Neuronen kein Glutathion-Transportsystem gibt. Cystein wird vor allem durch den Aminosäuretransporter EAAC1 in die Neuronen transportiert. Ich konnte in CHO Zellen eine erhöhte Cysteinaufnahme unter PrPC Abwesenheit messen und eine Interaktion von PrPC und EAAC1 mittels Ko-Immunopräzipitation nachweisen. Die Aufnahme von Glutamat über den EAAC1 hingegen ist in Zellen die PrPC exprimieren höher als bei Zellen die PrP-defizient sind. Da vermutet wird, dass die sogenannte Octarepeatregion im PrPC in der Lage ist ROS zuerkennen, wurde ein dominant-negatives Konstrukt (octa) des PrP hergestellt dem die Octarepeatregion fehlt. Die Aufnahme von Cystein bei Expression von octa zeigt keinen Unterschied zu Cysteinaufnahme in PrPC exprimierenden Zellen. Nach Behandlung mit Hydrogenperoxid erhöht sich die Cysteinaufnahme bei PrPC expimierenden Zellen, jedoch nicht bei octa exprimierenden und PrP-defizienten Zellen. Dies deutet daraufhin, dass die Octarepeatregion zwar wichtig ist für die Regulation des EAAC1, aber die Interaktion zwischen PrP und EAAC1 nicht über die Octarepeat-Region stattfindet.
Des Weiteren konnte ich in meiner Arbeit zeigen, dass die GFAP-Expression in PrP-defizienten Astrozyten und somit die Aktivierung von Astrozyten nach Hypoxie bzw. Reoxigenierung geringer ist als in Wildtyp-Astrozyten, dies führt wahrscheinlich zu der von mir beobachteten geringeren Migration der PrP-defizienten Astrozyten. Diese Beobachtung könnte die schnelle Regeneration von PrP-defizienten Mäusen nach Rückenmarksläsion erklären.
Ich konnte in meiner Arbeit zeigen, dass PrPC die Proteinzusammensetzung astrozytärer Exosomen reguliert und vielfachen Einfluss auf das Glutathion-System in Astrozyten und Neuronen nimmt, wodurch das Überleben vor allem von Neuronen unter oxidativem Stress erhöht wird.


Kurzfassung auf Englisch: The physiological function of the prion protein (PrP = prion related protein) is not clearly elucidated until now, but there is evidence that the cellular form of PrP (PrPC) plays an important role in protection against oxidative stress through detection of reactive oxygen species (ROS).
In this work, using a co-culture of neurons and astrocytes, I was able to show that wild-type cerebellar neurons survive better on wild-type astrocytes than on PrP-deficient astrocytes under oxidative stress. Furthermore, I was able to demonstrate that isolated exosomes from the culture medium of wild-type astrocytes, which were exposed to oxidative stress, increased the cell survival of wild-type cerebellar neurons, but exosomes isolated from untreated astrocytes or treated PrP-deficient astrocytes failed to support neuronal survival. The mass spectrometric analysis of exosomes from hypoxia-treated wild-type astrocytes and PrP-deficient astrocytes showed that the amounts of certain exosomal proteins are different in wild-type exosomes compared to PrP -deficient exosomes. By immunoblot I confirmed that clusterin (apolipoprotein J) was present in wild-type exosomes and the amount of clusterin decreases after hypoxia, whereas clusterin was hardly detectable in PrP-deficient exosomes and did not change after hypoxia. The amount of apolipoprotein E on the other hand was increased in wild-type exosomes after hypoxia and remained unchanged in PrP-deficient exosomes after hypoxia. These results show that PrPC not only has an impact on the protection mechanisms of the cell but also modulates the composition of exosomes and protection of cells against oxidative stress.
The glutathione system is the main mechanism to protect cells against ROS and xenobiotics via a redox mechanism. I was able to show that the amount of glutathione in the brains of adult wild-type mice and PrP-deficient mice does not differ. However, I was able to prove that in not-treated PrP-deficient astrocytes, the amount of reduced glutathione was increased compared to the level seen in wild-type astrocytes, but was decreases after hydrogen peroxide (ROS donor) treatment while the amount of reduced glutathione in wild-type astrocytes remained almost unchanged after ROS treatment. In the medium of PrP-deficient astrocytes an increased amount of glutathione was observed after treatment with hydrogen peroxide, but not in the medium of wild-type astrocytes. By inhibition of the astrocytic glutathione export the increase could be reduced, revealing a higher sensitivity to the inhibitor of PrP-deficient astrocytes. These results indicate an interaction between PrPC and the glutathione transport system. In addition, I could show that the activity of the g -glutamyl transferase (GGT), that degrades glutathione extracellularly, is decreased in PrP-deficient astrocytes. The accumulation of reduced glutathione in the medium of PrP-deficient astrocytes may thus be caused a by a lower activity of the GGT in the knock out cells.
Due to the reduced degradation of extracellular glutathione less cysteine is available for the neurons. Neurons need cysteine to generate glutathione as there are no glutathione transporting systems in neurons. Cysteine is transported mainly by the amino acid transporter EAAC1 into neurons. I could measure increased cysteine uptake in CHO cells in the absence of PrPC and demonstrate an interaction of PrPC with EAAC1 by co- immunoprecipitation. The uptake of glutamate on the other hand, was higher in cells expressing PrPC than in cells that were deficient in PrP. Since it is assumed that the so-called octarepeat region in PrPC is able to recognize ROS, a dominant-negative construct (D octa) of PrP was produced lacking the octarepeat region. The uptake of cysteine in cells expressing Docta was not different from the cysteine uptake in PrPC expressing cells. After treatment with hydrogen peroxide, the cysteine uptake increased in PrPC expressing cells, but not in Docta expressing and PrP deficient cells. This indicates that the octarepeat region is important for the regulation of the interaction between PrPC and EAAC1, but this interaction does not take place via the octarepeat region.
Furthermore, I was able to show that the GFAP expression in PrP-deficient astrocytes, and thus the activation of astrocytes after hypoxia and reoxygenation, was lower than in wild-type astrocytes. This could lead to the observed reduced migration of PrP-deficient astrocytes and could explain the rapid regeneration of PrP-deficient mice after spinal cord lesion.
I have shown in my work that PrPC regulates the composition of proteins in exosomes and has multiple effects on the glutathione system in astrocytes and neurons, causing an increase in cell survival mainly of neurons under oxidative stress.

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