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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-66710
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2014/6671/


Herstellung und Charakterisierung von Antikörper-Fragmenten zum Nachweis von Mitgliedern der CEACAM-Familie

Maßlo, Christoph

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Antikörperfragment , CEACAM , Tumorantigen , scFv , VHH
Freie Schlagwörter (Englisch): antibody fragment , CEACAM , tumor antigen , scFv , VHH
Basisklassifikation: 42.13
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Wagener, Christoph (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 18.10.2013
Erstellungsjahr: 2013
Publikationsdatum: 20.03.2014
Kurzfassung auf Deutsch: Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Generierung und Charakterisierung von Antikörper- Fragmenten zum Nachweis von Mitgliedern der CEACAM-Familie, die als Zelladhäsionsproteine in zahlreichen physiologischen und pathologischen Prozessen eine wichtige Rolle spielen, u.a. als Pathogenrezeptoren, Mediatoren der Angiogenese sowie als Tumorantigene. In diesem Zusammenhang wurden vor der Generierung von Antikörper- Derivaten die intakten monoklonalen Antikörper T84.1 und T84.66 aus Hybridomkulturen gewonnen und ihr Bindungsverhalten für unterschiedliche CEACAM-Proteine in verschiedenen Assay-Systemen untersucht. Weiter wurde der mAk T84.1 mit CEACAM pan- Spezifität in Studien für den Nachweis zellulärer CEACAM-Antigene auf Tumorzellen in vitro und in vivo hinsichtlich möglicher molekulardiagnostischer Anwendungen getestet (Heine et al., 2011).
Zudem wurden für die monoklonalen Antikörper T84.1 und T84.66 in dieser Arbeit analoge Einzelkettenfragmente (scFv; single chain variable fragment) kloniert und exprimiert, die sich aus den Antigen-bindenden Domänen der mAk zusammensetzen. Für mAk T84.1 wurde ein entsprechendes Gen-Segment durch rekombinante PCR- und Klonierungstechniken auf Basis von RNA aus Zellen der T84.1 Hybridomzelllinie neu generiert. Dabei konnte auch die bisher unbekannte Nukleotid-Sequenz für die Antigen-bindenden Bereiche des korrespondierenden T84.1 mAk ermittelt werden. Für beide scFv-Fragmente konnte darüber hinaus eine Strategie zur effizienten Modifikation durch enzymatische Biotinylierung im Rahmen der eukaryotischen Expression umgesetzt werden, welche die Grundlage für den Nachweis, die Aufreinigung sowie ein breites Spektrum an Funktionalisierungen in Hinblick auf verschiedene Einsatzmöglichkeiten schuf. Die gemeinsame Charakterisierung mit den analogen mAk in verschiedenen Immunosassays zeigte für die scFv-Fragmente ein vergleichbares Maß an Bindungsstärke und Spezifität für rekombinante und zelluläre CEACAM-Antigene, was ihre potentielle Einsetzbarkeit unter Erhalt der Spezifität und Funktionalität für molekulardiagnostische Zwecke bestätigte.
Als weiterer wesentlicher Aspekt dieser Arbeit wurde versucht, gegen CEACAM gerichtete Einzeldomänenantikörper bzw. VHH-Fragmente (variable domain of heavy-chains of heavy- chain-only antibodies) zu erzeugen, die sich von speziellen Schwerkettenantikörpern der Cameliden ableiten und die kleinsten bekannten Antikörperderivate darstellen. Für den Erhalt von CEACAM-reaktiven VHH-Fragmenten wurden eine Immunisierung von L. glama mit rekombinantem CEACAM1 und CEACAM5 vorgenommen. Nach Feststellung einer spezifischen Immunantwort sowie Charakterisierung der Lamaseren und enthaltenen cIgG- Fraktionen hinsichtlich der differenziellen CEACAM-Spezifität wurde aus Immunbibliotheken die Selektion spezifischer Fragmente durch phage display vorgenommen. Dabei konnten vier verschiedene Klone aus insgesamt zwei Gruppen von unterschiedlichen Sequenzmotiven identifiziert werden, deren VHH-Fusionsproteine spezifische Bindungsaktivität für CEACAM1 zeigten. Diese stellen den Ausgangspunkt für die mögliche weitere Generierung und den experimentellen Einsatz einer neuen Spezies von potentiell diagnostisch bzw. therapeutisch nutzbaren Antikörper-Fragmenten dar.
Kurzfassung auf Englisch: The aim of the present work was to generate and characterize antibody fragments for the specific detection of members of the CEACAM cell adhesion molecule family, which play an important role in several physiological and pathological processes, e.g. as pathogen receptors, mediators of angiogenesis or as tumor antigens. In this context, the full-length monoclonal antibodies T84.1 and T84.66 were initially expressed from cultures of hybridoma cells and tested with regard to their binding properties for CEACAM proteins by different assay systems. The CEACAM pan-specific mAb T84.1 has been further applied in cooperative studies to detect cellular CEACAM antigens on tumor cells in vitro and in vivo in respect of possible usage for molecular diagnostic purposes (Heine et al., 2011).
Furthermore, single-chain fragments (scFv) for T84.1 and T84.66 mAb were cloned and expressed, consisting of the antigen-binding domains from corresponding mAbs. Following the general structural attributes of given scFv T84.66, a single-chain fragment for T84.1 mAb was newly generated by recombinant cloning and PCR methods. This approach also led to the revelation of the nucleotide sequence coding the antigen-binding variable domains of T84.1 mAb, which has not been described so far. For both of the scFv fragments, a strategy for efficient modification via enzymatic attachment of biotin within eukaryotic expression was successfully established, which enabled sensitive detection and purification, offering a broad range of feasible functionalization possibilities for future applications as well. Characterization of scFv’s in parallel to mAbs by different immunoassays demonstrated comparable properties for the single-chain fragments regarding their binding specificities and verified their potential applicability for molecular diagnostic purposes.
As an additional main part of this work, an attempt was waged to generate CEACAM-specific single-domain antibodies (sdAb) or VHH fragments derived from heavy-chain-only antibodies of camelid origin. For this aim, llamas were immunized with recombinant CEACAM1 and CEACAM5. After confirmation of an appropriate immune response, llama whole sera as well as the different cIgG antibody subclass fractions were characterized for CEACAM specificity and accordingly constructed immuno-libraries were selected via phage display techniques in order to yield recombinant CEACAM-reactive VHH fragments. This led to the identification of a total number of four unique clones forming two different sequence homology groups, whose VHH fusion proteins exhibited specific binding to CEACAM1, thus providing a starting point for the generation and experimental testing of novel, potential diagnostic and therapeutic antibody fragment species directed against CEACAM1.

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