Biotechnologie von Theobroma cacao L.

Abstract

Im Zuge der Nacherntebehandlung von Rohkakao, der Fermentation, werden durch mikrobiellen Pulpaabbau Ethanol und später Essigsäure erzeugt bei gleichzeitiger deutlicher Temperaturerhöhung auf über 45°C. Diese Bedingungen in der Fermentationsmasse führen im Samen zu einer Ansäuerung des Kotyledonengewebes und – als Folge davon zu einer massiven Proteolyse der Speicherproteine durch endogene, bei Gewebeansäuerung aktivierte Proteasen. Die Spaltungsaktivität der Proteasen und die stark konservierten Aminosäuresequenzen der Proteine liefern ein definiertes Muster der Aromavorstufen des Kakaos. In der vorliegenden Arbeit werden analog zu den Bedingungen in der Fermentation durch Inkubationen der Samen in entsprechenden sauren Medien mit verschiedenen pH-Werten und unterschiedlichen Säuren die grundsätzlichen Einwirkungen dieser Faktoren auf die Samen in Hinsicht auf die Proteolyse untersucht. Um den Fermentationsbedingungen zu entsprechen, werden die Inkubationen bei verschiedenen Temperaturen ausgeführt. Der höchste Gehalt an freien Aminosäuren wird bei einem pH-Wert von 2,9, einer Essigsäurekonzentration von 100mM und einer Temperatur von konstant 41°C erreicht. Die Abtötung der Samengewebe ließ sich über die Freisetzung der phenolischen Inhaltsstoffe in das Medium nachweisen. Eine Temperatur von über 50°C ist eindeutig als zellmembranschädigend einzustufen. Ebenso zerstört eine Säurekonzentration von über 300mM Essigsäure die Membran und lässt sich durch die Freisetzung der phenolischen Substanzen nachweisen. Die direkte Einwirkung dieser externen Faktoren wird durch das Vorhandensein einer intakten Samenschale verzögert, so dass diese strukturelle Komponente als eine Barriere zwischen Inkubationsmedium und Samenspeichergewebe nachweisbar ist. Von besonderer Bedeutung erweist sich eine bislang kaum untersuchte stark quellbare Schleimschicht, die nach der Entfernung der Pulpa durch Behandlung mit Pectinex BE XXL® aus Schleimbehältern durch Quellung gebildet wird und die bei intakter Pulpa noch in speziellen Höhlungen oder Kavernen in der äußeren Lage der Testa vorliegt. Weitergehende Analysen des Schleims belegen, dass nach Hydrolyse überwiegend Aminosäuren vorhanden sind und nur geringe Mengen freie Zucker nachweisbar sind. Die elektrophoretischen Analysen des Schleims belegen, dass ca. 30 trennbare Eiweiße nach SDS-Elektrophorese vorliegen. Mit Hilfe von HPLC-MS lassen sich drei Eiweiße im Schleim charakterisieren, die eine fungizide Wirkung haben. Die Bedeutung dieser Komponenten für die Samenkeimung und Fermentation wird diskutiert.

In the course of the post-harvest treatment of cocoa beans, the fermentation, the pulp is microbially degraded. While the temperature constantly rises to about 45°C first ethanol, then acetic acid is produced. The conditions in the fermentation mass entail the acidification of the cotyledon tissue and an extensive proteolysis of storage proteins. The latter is carried outby endogenous proteases that are activated by acidic conditions. The cleavage activity of the proteases as well as the conservative amino acid sequences of storage proteins provide a defined pattern of flavor precursors of cocoa. In the study at hand seeds have been incubated under conditions analog to those of the fermentation. Media with different pH-values – all in the acid range – and different organic acids have been used. The basic effects of these factors on the seed with regard to the proteolysis are examined. In order to imitate the temperature conditions of fermentation, incubations are carried out under the influence of different temperature-regimes. The highest content of free amino acids is achieved under the influence of a pH-value of 2.9, an acetic acid concentration of 100mM and a constant temperature of 41°C. A temperature of about 50°C as well as an acetic acid concentration higher than 300mM lead to a damage of the cell membrane. This destruction of the seed tissue and the following release of phenolic compounds can be verified by the detection of the latter in the medium. The direct impact of these external factors is delayed by the presence of an intact seed coat. This structural component is considered as a barrier between incubation medium and seed storage tissue. A so far hardly studied strongly swellable layer of mucilage is of particular importance. It is formed out of slime containers by swelling after removal of the pulp by treating the seed with Pectinex BE XXL®. Even in seeds with an intact pulp this mucilage is proven to be present in special cavities or caverns in the outer layer of the testa. Further analyzes demonstrate that the prominent hydrolysis products of the mucilage are amino acids. Only a few free sugars are detectable. The electrophoretic analysis of the mucilage demonstrates that about 30 proteins can be separated by SDS electrophoresis. Via HPLC-MS three of those proteins could be characterized. These proteins were shown to have an antifungal effect. The importance of these proteins for seed germination and fermentation is discussed.