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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-67033
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2014/6703/


Evaluation of two molecular-based therapies in a mouse model of hypertrophic cardiomyopathy

Entwicklung von zwei molekularen Therapieansätzen in einem Mausmodell der hypertrophischen Kardiomyopathie

Stimpel, Doreen

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SWD-Schlagwörter: Hypertrophische Herzmuskelkrankheit , Gentherapie
Freie Schlagwörter (Deutsch): Myosin-bindendes Protein-C , 5\'-trans-splicing , Wildtyp-Mybpc3-Gentransfer , Adeno-assoziierte Viren
Freie Schlagwörter (Englisch): Myosin-binding protein-C , 5\'-trans-splicing , wildtype Mybpc3 gene transfer , adeno-associated virus
Basisklassifikation: 42.13 , 44.38 , 44.85
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Heisig, Peter (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 19.12.2013
Erstellungsjahr: 2013
Publikationsdatum: 01.04.2014
Kurzfassung auf Englisch: Hypertrophic cardiomyopathy (HCM) is the most common heart disease and lacks curative treatment. More than 460 mutations in the MYBPC3 gene encoding cardiac myosin-binding protein C (cMyBP-C) have been identified in affected patients. Among them, about 70% are frameshift or nonsense mutations and are expected to produce C-terminal truncated cMyBP-C proteins. Although pathophysiological mechanisms are not fully enlightened, the lack of full-length wild-type cMyBP-C protein and/or the presence of truncated cMyBP-C proteins were sufficient to alter sarcomere homeostasis and contributed to cardiac phenotype in animal models and patients carrying MYBPC3 mutations. This work highlighted molecular therapies to address the genetic cause in HCM. The Mybpc3-targeted knock-in mouse model (KI), carrying a splice site mutation, is a suitable disease model of cMyBP-C protein truncation and haploinsufficiency. The KI mice show pronounced hypertrophic phenotype, with left ventricular hypertrophy and cardiac dysfunction at early ages.
The thesis addressed two major questions:
Is 5’-trans-splicing suitable to correct disease-causing mutation at pre-mRNA level and prevent the accumulation of poison polypeptides in the mouse model of HCM?
Is the conventional wild-type Mybpc3 gene therapy sufficient to compensate for the cMyBP-C protein haploinsufficiency in the mouse model of HCM?
The 5’-trans-splicing strategy has been an innovative therapeutic technology to modify disease-causing splicing defects by splicing together the endogenous mutant pre-mRNA and engineered pre-trans-splicing molecules (PTMs). PTMs were designed according to the particular mutational context and carried only a fraction of the wild-type Mybpc3 cDNA. PTMs were packaged in adeno-associated virus (AAV) serotype 6 and 9 under the control of a cardiomyocyte-specific promoter and applied to isolated cardiomyocytes and in vivo in the KI mouse, respectively. This study provided the first evidence of successful mRNA repair by 5’-trans-splicing ex vivo and in vivo in the field of cardiac genetic diseases. However, the amount of repaired cMyBP-C protein was rather low and not sufficient to rescue the cardiac phenotype after 7 weeks of PTM delivery in KI mouse.
The second study provided proof-of-concept that transfer of full-length wild-type Mybpc3 cDNA, encoding the functional version of the cMyBP-C protein, in isolated cardiomyocytes and in vivo in KI mouse rescued the molecular and/or functional phenotype. After AAV-mediated wildtype Mybpc3 gene transfer in isolated cardiomyocytes, the level of total Mybpc3 mRNAs reached the level of WT cardiomyocytes and unexpectedly, the transcription of mutant Mybpc3 mRNAs was markedly suppressed. Pilot in vivo experiment demonstrated that the exogenous Mybpc3 gene transfer successfully prevented left ventricular hypertrophy and cardiac dysfunction after 7 weeks of a single administration in KI mouse and rescued the molecular phenotype. It certainly resulted in equivalent Mybpc3 mRNA and cMyBP-C protein level as identified in WT animals and reduced the expression of the endogenous mutant allele. Hence, conventional gene therapy targeted both haploinsufficiency and the accumulation of mutant polypeptides.
These studies opened new horizons towards a causal therapy of HCM.
Kurzfassung auf Deutsch: Die hypertrophe Kardiomyopathie (HCM) ist eine der am häufigsten angeborenen Erkrankungen der Herzmuskulatur, für die bislang keine kausalen Therapieoptionen existieren. Ursächlich ist oft eine Mutation im Gen MYBPC3, welches für das kardiale Myosin-bindende Protein-C (cMyBP-C) kodiert. Mehr als 460 Mutationen wurden bis heute in diesem Gen beschrieben. Die meisten MYBPC3-Mutationen (˃70%) sind frameshift oder nonsense Mutationen und lassen C-terminal trunkierte cMyBP-C-Proteine erwarten. Die Pathomechanismen, die letztendlich zur Hypertrophie führen, sind nicht vollständig aufgeklärt. Es wird diskutiert, dass eine unzureichende Gesamtmenge an Wildtyp-cMyBP-C-Protein und zugleich eine Kumulation von trunkierten cMyBP-C-Polypeptiden zur Ausbildung des HCM-Phänotyps sowohl in HCM-Tiermodellen, als auch in betroffenen Mutationsträgern beitragen. Das Ziel dieser Doktorarbeit war es, molekulare Therapieansätze zu entwickeln, die gegen die genetische Ursache der Erkrankung gerichtet sind und den HCM-auslösenden Pathomechanismen entgegenwirken. Der Fokus lag auf einem Mybpc3-knock-in- (KI-) Mausmodell, welches eine im Menschen beschriebene MYBPC3-Mutation trägt. Phänotypisch führt die Mutation in der homozygoten KI-Maus zu einer linksventrikulären Hypertrophie, sowie einer kardialen Dysfunktion und einer deutlich reduzierten Gesamtmenge an Mybpc3-mRNA und cMyBP-C-Protein. Demzufolge stellt die KI-Maus ein geeignetes HCM-Krankheitsmodell der cMyBP-C-Protein-Trunkierungen und Haploinsuffizienz dar.
In dieser Doktorarbeit wurden speziell zwei Fragestellungen untersucht:
Ist die 5‘-trans-splicing-Methode geeignet, die HCM-verursachende Mutation auf prä-mRNA-Ebene zu korrigieren und die Akkumulation von trunkierten cMyBP-C-Polypeptiden in dem Mausmodell zu verhindern?
Ist die Wildtyp-Mybpc3-Gentherapie geeignet, um der krankheitsauslösenden cMyBP-C-Protein-Haploinsuffizienz in dem Mausmodell entgegenzuwirken?
Die RNA-basierte trans-splicing-Strategie bezeichnet im Allgemeinen das gezielte Zusammenspleißen von Exons verschiedener RNA-Moleküle. Um das durch die Mutation hervorgerufene ungewollte Spleißen der endogenen Mybpc3-prä-mRNA zu verhindern, wurden ‘pre-trans-splicing molecules‘ (PTMs) konstruiert. Die PTMs codierten für einen Teil der Wildtyp-Mybpc3-Sequenz, welche durch 5‘-trans-splicing den defekten Abschnitt der mutierten Mybpc3-prä-mRNA ersetzen sollten. Für den gezielten exogenen Gentransfer wurden die PTMs unter Kontrolle eines kardiomyozyten-spezifischen Promotors in adeno-assoziierte Viren (AAV) des Serotyps 6 und 9 verpackt. Die Durchführbarkeit und Effizienz des PTM-induzierten 5‘-trans-splicing wurde in kultivierten neonatalen KI-Kardiomyozyten und anschließend in vivo in der KI-Maus evaluiert. Die Untersuchungen lieferten den ersten Hinweis auf eine erfolgreiche Korrektur der ursprünglich mutierten Mybpc3-mRNA mittels 5‘-trans-splicing ex vivo und in vivo im Bereich der genetischen Herzerkrankungen. Allerdings war die Menge reparierten cMyBP-C-Proteins verhältnismäßig gering und reichte nicht aus, um den kardialen Phänotyp bis zu 7 Wochen nach PTM-Applikation zu verbessern.
Im zweiten Teil der Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Gentherapie mit der Wildtyp-Mybpc3-cDNA den molekularen bzw. den funktionellen kardialen Phänotyp in kultivierten neonatalen KI-Kardiomyozyten bzw. in vivo in der KI-Maus verbesserte. Die Wildtyp-Mybpc3-Sequenz wurde erfolgreich in AAV des Serotyps 6 und 9 unter Kontrolle eines kardiomyozytenspezifischen Promotors kloniert. Nach erfolgter ex vivo-Behandlung war die Gesamtmenge an cMyBP-C-Protein vergleichbar in den Wildtyp-Mybpc3 behandelten KI- und in den unbehandelten WT-Kardiomyozyten. Die Transkription der mutierten Mybpc3-mRNAs wurde zugleich merklich unterdrückt. Der AAV9-vermittelte in vivo-Wildtyp-Mybpc3-Gentransfer hatte einen positiven Einfluss auf den Phänotyp einer KI-Maus und verhinderte die Ausbildung einer linksventrikulären Hypertrophie und kardialen Dysfunktion. Es wurden äquivalente cMyBP-C-Proteinmengen wie in WT-Mäusen detektiert und zugleich die Expression des endogenen mutierten Alleles erfolgreich supprimiert. Die Wildtyp-Mybpc3-Gentherapie hat der HCM-auslösenden cMyBP-C-Protein-Haploinsuffizienz entgegenwirkt und die Akkumulation von möglicherweise toxischen cMyBP-C-Polypeptiden verhindert.

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