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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-67490
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2014/6749/


Molecular evaluation of IgE reactivity in Hymenoptera venom allergy

Molekulare Evaluation der IgE Reaktivität im Falle der Hymenopteren Gift-Allergie

Bantleon, Frank

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SWD-Schlagwörter: Allergie
Freie Schlagwörter (Deutsch): IgE Reaktivität , Carbohydrat-basierte Kreuzreaktivität , Hymenopteren Gift-Allergie
Freie Schlagwörter (Englisch): IgE reactivity , carbohydrate-based cross-reactivity, hymenoptera venom-allergy
Basisklassifikation: 35.70
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Bredehorst, Reinhard (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 28.03.2014
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 15.05.2014
Kurzfassung auf Englisch: The background of this PhD-thesis is based on the Hymenoptera venom allergy and the associated complex of problems of severe anaphylactic reactions. In general around 0.3 to 8.9% of the population suffer from systemic reactions after a Hymenoptera sting. Allergic reactions are frequently provoked by stings of honeybee (Apis mellifera) and yellow jacket (Vespula vulgaris). In this context 10 to 20 fatal causalities are reported in Germany per annum; in other countries the rate is between 0.1 to 0.5 per million inhabitants and it can be assumed that the estimated number of unreported cases is much higher. As permanent therapy of allergies the so called “specific immunotherapy” (SIT) has been established. In the case of Hymenoptera venom allergy a proper diagnosis and identification of the allergy provoking insect is a prerequisite for such therapy. In vitro diagnostic is based i.a on determination of IgE reactivities against the venom; however this is hampered by the complexity of the venoms.
A molecular, component resolved analysis of IgE reactivities offers an opportunity to distinguish relevant IgE reactivities from clinical irrelevant cross-reactivities.
Therefore in the context of this work several different honeybee venom allergens were expressed in insect cells. The choice of the expression system offers the opportunity to avoid the establishment of cross-reactive carbohydrate determinants (CCDs). Beside biochemical and allergogenic characterisation of the allergens, coupling on a diagnostic surface allowed analyses of IgE reactivities to the allergens by the use of a great cohort of patient sera. Thereby for the first time insights into the recognition patterns of allergic patients and the relevance of particular allergens could be obtained. Additional allergens relevant for therapy could be identified and the diagnostic sensitivity could be enhanced and improved from 72 to 94% by this component resolved diagnostic.
Another aspect of this work is represented by the phenomena of IgE reactivities to CCDs. In this case IgE antibodies are binding specific to the α-1,3-core fucose epitope, which is present on glycosylated Hymenoptera venom allergens. The circumvention of the epitope formation offers diagnostic benefits, however the relevance of this reactivity is still unclear. For the detection of such reactivities marker proteins which bear different CCD epitopes are widely used rendering a differentiation and fine analysis difficult. Therefore a set of glyco-engineered insect cell lines was established by the stable transfection of different Lepidoptera species with CCD relevant glycosyltransferases. These cell lines were used for the expression of a human serum protein with defined glycosylation pattern. The resulting glycoproteins were used to obtain reactivity profiles of Hymenoptera venom and pollen allergic patients and to analyse the prevalence of IgE reactivity for particular carbohydrate structures. As inert scaffold protein alpha-2HS-glycoprotein was chosen, because as high IV
abundance serum protein it should not show any protein-based cross-reactivity. Additionally it bears two glycosylation-sites, which can be easily modified upon expression in the different glyco-engineered insect cell lines. It could be shown, that IgE reactivities to the fucose epitope dominate compared to the xylose epitope in the case of Hymenoptera venom allergic patients.
Moreover analyses for the establishment and recognition of CCDs by specific antibodies and glycosyltransferases were performed. By the use of recombinant expressed glycosyltransferases and using STD NMR based analyses, first insights into the recognition of the carbohydrate core by human fucosyltransferase 8 and the honeybee α-1,3-core fucosyltransferase could be obtained. Interestingly an appropiate affinity of the enzyme to its acceptor is secured by the previous binding of the donor. To obtain findings of the recognition of CCDs by high affinity antibodies, α-1,3-core fucose specific antibody fragments were selected from a rabbit immune library for the first time. Subsequently this antibody fragments were converted into different human antibodies classes and used for structural as well as for functional analysis. By the recombinant approach the pronounced potential to activate effector cells of these antibodies was demonstrated, which confirms the biological relevance and therefore also the potential clinical significance. In structural analyses the relevance of core fucose as well as the importance of the carbohydrate core for the binding of CCD specific antibodies could be confirmed. The obtained insights contribute significantly to the comprehension of the interaction of the adaptive immune system with the environment and the allergy in particular.
Kurzfassung auf Deutsch: Den Hintergrund dieser Arbeit bildet die Hymenopterengiftallergie und die mit ihr verbundene Problematik schwerer anaphylaktischer Reaktionen. Generell zeigen ca. 0.3-8.9% der Bevölkerung systemische Reaktionen auf Insektenstiche, wobei häufig allergische Reaktionen nach Stichen der Honigbiene (Apis mellifera) und der Wespe (Vespula vulgaris) auftreten. Hierbei kommt es zu ca. 10-20 Todesfällen pro Jahr in Deutschland; in anderen Ländern liegt die Rate bei 0.1-0.5 pro 1 Million Einwohnern, wobei generell anzunehmen ist, dass die Dunkelziffer weit höher liegt. Zur dauerhaften Therapie von Allergien hat sich die sogenannte „spezifische Immuntherapie“ (SIT) etabliert, wobei im Falle der Hymenopterengiftallergie zunächst eine sorgfältige Diagnose und Identifikation des allergieauslösenden Insekts erfolgen muss. Eine in vitro Diagnostik basiert u.a. auf der Bestimmung von IgE Reaktivitäten gegen das Gift, was jedoch durch die Komplexität des Giftes erschwert wird. Eine molekulare, Komponenten-aufgelöste Analyse der IgE-Reaktivität ist hier die einzige Option, relevante IgE Reaktivitäten und klinisch irrelevante Kreuzreaktivitäten zu unterscheiden.
Im Rahmen dieser Dissertation wurden daher unterschiedliche Allergene des Giftes der Honigbiene durch Expression in Insektenzellen dargestellt. Die Wahl des Expressionssystems bot hier die Möglichkeit, die Etablierung kreuzreativer Carbohydrat-Determinanten (CCD) zu umgehen. Neben einer biochemischen und allergologischen Beschreibung der Allergene konnten selbige nach Kopplung an Träger unter Verwendung eines großen Kollektivs von Patientenseren hinsichtlich ihrer IgE-Reaktivität analysiert werden. Hierbei konnten erstmalig Einblicke in die individuellen Erkennungsmuster allergischer Patienten und die Bedeutung der jeweiligen Allergene gewonnen sowie die für eine Therapie besonders kritischen Allergene identifiziert werden. Darüber hinaus kann durch Komponenten-Auflösung die Sensitivität der Diagnostik von ca. 72% auf 94% verbessert werden.
Einen weiteren interessanten Aspekt der Arbeit stellt das Phänomen der IgE-Reaktivität mit CCDs dar. Hierbei binden IgE-Antikörper spezifisch das α-1,3-core Fukose-Epitop, welches auf glykosylierten Insektengift-Allergenen vorhanden ist. Die Umgehung der Etablierung dieser Epitope bietet diagnostische Vorteile, allerdings ist die Bedeutung dieser Reaktivität nach wie vor unklar. Für die Detektion einer solchen Reaktivität werden bislang Marker-Proteine eingesetzt, die unterschiedliche CCD Epitope tragen, was eine Differenzierung und Feinanalyse verhindert. Aus diesem Grunde wurde ein Satz von glykomodifizierten Insektenzelllinien etabliert, indem Zelllinien unterschiedlicher Lepidoptera-Arten mit CCD relevanten Glycosyltransferasen transfiziert wurden. Diese Zelllinien wurden dann zur Expression eines humanen Serumproteins verwendet, das entsprechend definierte Glykosylierungsmuster aufwies. Die so erhaltenen Glykoproteine wurden dann eingesetzt um Reaktivitätsprofile von Hymenopterengift- und Pollen-Allergikern zu erstellen und die Prävalenz einer IgE-Reaktivität für einzelne Carbohydrat-Strukturen zu analysieren. Als inertes Trägerprotein wurde α-2-Heremanns-Schmid-Glykoprotein verwendet, da dieses als humanes Serumprotein keine Reaktivität mit humanen IgE-Antikörpern zeigen sollte und es zwei Glykosylierungsstellen aufweist, die durch die Expression in den unterschiedlichen Zelllinien modifiziert werden können. Hierbei konnte klar gezeigt werden, dass IgE-Reaktivitäten mit dem Fukose-basiertem Epitop gegenüber dem Xylose-Epitope bei Insektengift-Allergikern dominieren.
Im Weiteren wurden Analysen zur Etablierung bzw. Erkennung von CCDs durch spezifische Antikörpern bzw. Glykosyltransferasen durchgeführt. Unter Verwendung rekombinant produzierter Glykosyltransferasen und mittels STD NMR basierter Untersuchungen konnten erste mechanistische Einblicke in die Erkennung des Zucker-Cores durch die humane Fukosyltransferase 8 und α-1,3-core Fukosyltransferase der Honigbiene gewonnen werden. Interessanterweise wird z.B. eine adäquate Affinität des Enzyms zu seinem Akzeptor erst durch die Bindung des Donors sichergestellt.
Um Erkenntnisse zur Erkennung von CCDs durch hochaffine IgE zu erhalten, wurden erstmalig α-1,3-core Fukose-spezifische Antikörper-Fragmente aus einer leporiden Immunrepertoire-Bibliothek selektiert. Anschließend wurden diese Antikörper-Fragmente in unterschiedliche humane Antikörpertypen konvertiert und diese sowohl für strukturelle als auch funktionelle Analysen eingesetzt. Durch den rekombinanten Ansatz konnte erstmalig ein ausgeprägtes Potential dieser Antikörper zur Aktivierung von Effektor-Zellen nachgewiesen werden, was die biologische Relevanz und damit die mögliche klinische Relevanz bestätigt. In strukturellen Analysen konnte die Relevanz der core-Fukose sowie die Bedeutung der core-Struktur als solche für die Bindung von CCD-spezifischen Antikörpern bestätigt werden.
Die in dieser Arbeit erhaltenen Einblicke tragen wesentlich zum Verständnis der Interaktion des adaptiven Immunsystems und der Umwelt generell und in der Allergie im Besonderen bei.

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