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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-67721
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2014/6772/


Optimierung des T-Zell-Rezeptor-Gentransfers in primären T-Zellen für die adoptive Immuntherapie

Berdien, Belinda

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Gentherapie , TCR Knockout, T-Zellen , T-Zell-Rezeptor , TALEN
Freie Schlagwörter (Englisch): Gentherapy , TCR knockout , T cells , T-cell receptor , TALEN
Basisklassifikation: 42.32 , 42.13 , 42.15 , 42.20 , 44.45
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Fehse, Boris (Prof., Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 25.10.2013
Erstellungsjahr: 2013
Publikationsdatum: 04.06.2014
Kurzfassung auf Deutsch: Die Umprogrammierung von T-Zellen durch die Transduktion spezifischer T-Zell-Rezeptoren (TCR) ist ein effektiver Ansatz für die adoptive Immuntherapie. Diese erfordert anspruchsvolle Techniken für die Identifikation und Klonierung geeigneter TCRs, sowie für die Transduktion von primären T-Zellen. Zugleich stellt das TCR-Mispairing, die unerwünschte Paarung transgener TCR-Ketten mit komplementären endogenen Ketten, eine große Herausforderung der TCR-Gentherapie dar.
Das Ziel dieser Arbeit bestand in der Optimierung des TCR-Gentransfers in primären T-Zellen, wozu als Modellsystem ein influenzaspezifischer (Flu) TCR verwendet wurde.
Im ersten Teil der Arbeit wurden Optimierungen durchgeführt, die primär zu einer verstärkten Transgenexpression des Flu-TCR geführt haben. Dabei konnte ein neuer lentiviraler Vektor (LeGO-MP) entwickelt werden, der eine signifikante Erhöhung der Expressionsstärke von Transgenen in T-Zelllinien und in primären T Zellen gegenüber dem bisherigen lentiviralen Vektor ermöglichte. Bei der Optimierung der verwendeten Expressionskassette wurde gezeigt, dass die stärkste Expression der TCR-Ketten über die 2A-Sequenz des porzinen Teschovirus in der Konfiguration TCRβ-2A-TCRα erreicht wird. Nach zusätzlicher Kodonoptimierung und Murinisierung der transgenen Flu-TCR-Sequenzen konnte erstmals die Generierung von aktiven influenzaspezifischen primären Effektor-T-Zellen gezeigt werden, die durch starke Sekretion von IL-2, IFN-γ und TNF-α nach Kontakt zu ihrem Antigen charakterisiert waren.
Der zweite Teil der Dissertation widmete sich der Verhinderung des TCR-Mispairings durch das Ausschalten der endogenen TCR-Gene mit Hilfe von TAL-Effektor-Nukleasen (TALEN). Nach Identifizierung der TCR-spezifischen TALEN und nach Optimierung von Transportmethoden und Kulturbedingungen konnte erstmals ein Knockout der endogenen TCRα- und TCRβ-Ketten durch TALEN-mRNA-Elektroporation in primären T Zellen nachgewiesen werden. Durch den sukzessiven Knockout der endogenen TCR-Ketten und der jeweils anschließenden Transduktion mit den entsprechenden Flu-TCR-Ketten wurde eine komplette Umprogrammierung von primären T-Zellen erreicht. Diese Zellen zeigten aufgrund der Abwesenheit des TCR-Mispairings deutlich verbesserte Flu-Oberflächenexpression sowie verstärkte Effektorfunktionen.
Insgesamt wurden in dieser Arbeit Methoden entwickelt, die zu einer verstärkten TCR Expression in primären T-Zellen sowie zur kompletten Verhinderung des TCR-Mispairings geführt haben. Diese können bei klinischen Anwendungen der adoptiven TCR-Immuntherapie zukünftig von großem Nutzen sein.
Kurzfassung auf Englisch: Engineering T cells with antigen specific T-cell receptors (TCR) represents a promising strategy in adoptive immunotherapy. The approach of identification and cloning of suitable TCRs and the transduction of primary T cells remains technically demanding. Moreover TCR mispairing, the incorrect pairing between an introduced α/β chain and the complementary endogenous TCR α/β chain, remains a major challenge in the field of TCR gene therapy.
The main goal of this thesis was the optimization of TCR gene transfer in primary T cells by using influenza virus (Flu)-specific T-cell responses as a model system.
The goal of the first part of the thesis was the development of strategies facilitating enhanced surface expression of Flu-TCR molecules. In this process a novel lentiviral self-inactivating vector (LeGO-MP) which significantly enhanced transgene expression in T-cell lines and primary T cells was developed. The optimization of the transgene cassette showed that the 2A element of the porcine Teschovirus as a linker for the TCR chains in the configuration TCRβ-2A-TCRα mediated the highest levels of TCR surface expression. Codon-optimization and murinization of the Flu-TCR chains led to the successful generation of active anti-Flu effector T cells, characterized by the secretion of high amounts of IL-2, IFN-γ und TNF-α after contact with their cognate antigen.
The second part of this thesis focused on the prevention of TCR mispairing by knocking out the expression of endogenous TCR chains with TCR specific TAL effector nucleases (TALEN). Following the identification and cloning as well as the optimization of delivery strategies and culture conditions for the TCR specific TALEN, an efficient knockout of the endogenous TCRα and TCRβ genes was, for the first time, successfully induced by TALEN-mRNA electroporation. The successive knockout of the endogenous TCR chains and the subsequent transduction of the appropriate Flu-TCR chains led to the complete editing of primary T cells. These cells showed enhanced surface expression and were superior at mediating effector functions, likely because of the absence of TCR mispairng.
In conclusion, new approaches for the enhanced surface expression of TCR molecules as well as for the complete prevention of TCR mispairing were successfully developed. Together these new techniques might be beneficial for the further development of TCR gene transfer for clinical applications of adoptive immunotherapy.

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