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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-68005
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2014/6800/


Untersuchung von epidermalen Ca2+-Gradienten in einem Mausmodell für Atopische Dermatitis unter Verwendung von 2-Photonen-Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie

Börnchen, Christian

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Atopische Dermatits , Calcium , 2-Photonen-Mikroskopie , Fluoreszenzlebensdauer
Basisklassifikation: 44.93
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Brandner, Johanna (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 22.11.2013
Erstellungsjahr: 2013
Publikationsdatum: 01.07.2014
Kurzfassung auf Deutsch: Calcium steuert eine Vielzahl von wichtigen Zellzuständen- und Abläufen, wie Proliferation, Differenzierung, Barriere-Funktion und -Erhaltung, sowie Aufbau und Funktion von Zell-Zell-Verbindungen in Keratinozyten. Viele dieser Informationen sind allerdings nur aus Zell-Kulturen bekannt. Daher ist es von großer Bedeutung in vivo-nahe Informationen über die Ca2+-Konzentration und deren Verteilung in der Epidermis zu erhalten. Dies hat sich bisher als schwierig erwiesen, da die Mehrzahl bisheriger Arbeiten Nachweismethoden benutzten, die eine Fixierung der Haut nötig machten und somit die Charakterisierung der Calcium-Verteilung in nativer Epidermis nicht erbracht werden konnte. Allerdings haben Fortschritte in der Laser- und Detektionstechnologie neue mikroskopische Methoden hervorgebracht, die es nun ermöglichen, Haut ex vivo in unterschiedlichen Zuständen auf deren Calcium-Verteilung zu untersuchen. In dieser Arbeit wurden zu Beginn zwei FLIM-Detektoren einem Vergleich unterzogen, um den geeignetsten Detektor für Messungen an muriner und humaner Haut herauszufinden. Anschließend wurde an einem Maus-Modell für Atopische Dermatitis (AlD-Mausmodell) die Calcium-Verteilung in gesunder und ekzematöser Haut mittels 2P-FLIM untersucht. Schließlich wurden die erhobenen Calcium-Parameter mit Differenzierungsmarkern, Proliferationsmarkern, Parametern ekzematöser Haut, Barriereparametern und der Lokalisationen von Tight Junction-Proteinen korreliert, um deren Zusammenhänge genauer zu untersuchen.
Die beiden zu vergleichenden FLIM-Detektoren basierten auf zwei unterschiedlichen Detektionsmethoden. Die Messungen der PicoStar wurden im Multi-Strahl-Modus betrieben und ermöglichten dadurch ein schnelleres Scannen des Probenareals. Die so erzeugte Fluoreszenz, bzw. Fluoreszenzlebensdauer wurde anschließend mit einem CCD-gestützten System in Zeitabschnitten detektiert. Der TCSPC wurde im Einzelstrahlmodus betrieben und detektierte die Fluoreszenz durch einen Multianoden-PMT mit einem parallelisierten Konvertersystem. Hierbei wurden Photonenereignisse einzeln aufgelöst. Das Ergebnis des Detektorvergleichs zeigte eindrücklich, dass der TCSPC sowohl in der Auflösung als auch in der Tiefenmessung in stark streuendem und weniger stark streuendem Gewebe die PicoStar übertrifft. Dies gilt besonders für die laterale Auflösung und FLIM-Messungen in Tiefen ab 90 µm.
Untersuchungen des AlD-Mausmodells auf Parameter des Ekzems zeigten, weitgehend (mit Ausnahme der Hydratation des Stratum corneums) Übereinstimmungen mit den charakteristischen Merkmalen eines atopischen Ekzems, die durch die Anzahl der Provokationen gezielt verstärkt werden konnten.
Die Calcium-Verteilung zeigte in gesunder Haut (von der Oberfläche der Haut aus gesehen) einen Anstieg im Stratum corneum bis zu einem Konzentrationsmaximum im Stratum granulosum (Calcium-SG), einen anschließenden Abfall der Konzentration unter die des Stratum corneums und einen stabil auf dieser Konzentration verbleibenden Verlauf bis zur Dermis (Calcium-Baseline). Im Vergleich der Calcium-Verteilung der Kontrolle zum Ekzem, stellte sich heraus, dass im Stratum granulosum höhere Ca2+-Konzentrationen vorherrschen und der Verlauf der niedrigen Ca2+-Konzentrationen verlängert ist, während die durchschnittliche Ca2+-Konzentration der Gesamtepidermis nur marginal verändert ist. Interessanterweise sind sowohl im Stratum granulosum gesunder, als auch ekzematöser Haut, höhere intrazelluläre Ca2+-Konzentrationen als extrazellulär gemessen worden. Kontroll-Messungen in vitro an HaCat-Zellen zeigten hingegen eine „normale“ Calcium-Verteilung von niedrigeren intrazellulären Werten gegenüber höheren extrazellulären Werten.
Die Korrelationen der Calcium-Parameter mit den Parametern des Ekzems ergaben beidseitig signifikant positive Korrelation der Infiltrathöhe und der Calcium-Baseline, wobei vermutet wird, dass der Initiator die Infiltrathöhe ist, da (1) die Infiltrathöhe darüber hinaus einseitig signifikant die Ca2+-Konzentration im Stratum granulosum beeinflusst und (2) das IgE-Level einseitig signifikant die Calcium-Baseline beeinflusst und (3) das gesamte Mausmodell auf einer immunologischen Reaktion basiert. Die Veränderungen der Parameter Calcium-SG und Calcium-Baseline sind ebenfalls beidseitig positiv signifikant mit Veränderungen der Epidermisdicke korreliert. Hier können bisher keine Aussagen über Initiator und Effektor der Veränderungen gemacht werden.
Die Korrelation von Calcium-Parametern und Differenzierungs- und Proliferationsmarkern ergab eine signifikant positive Korrelation der Calcium-Baseline und der Erhöhung der Proliferation. Weiter zeigte sich eine signifikante Korrelation von Keratin 14 und Keratin 10 (jedoch reziprok) mit der Calcium-Baseline: Je länger die Calcium-Baseline ist, desto länger wird Keratin 14, ein Marker für undifferenzierte Keratinozyten und desto später Keratin 10, ein früher Marker für differenzierte Keratinozyten exprimiert. Dieses Ergebnis stützt die Theorie, dass erhöhte Ca2+-Konzentrationen auch im Gewebeverbund der Haut die Proliferation vermindern und die Differenzierung beeinflussen. Eine signifikante Korrelation zum späten Differenzierungsmarker Filaggrin und den Calcium-Parametern wurde allerdings nicht gefunden.
Korrelationen der Calcium-Parameter mit Tight Junction-Proteinen, von denen bekannt ist, dass sie die Calcium-Permeabilität von Zellen beeinflussen, zeigten eine positive Korrelation der Calcium-Baseline mit der Herabregulation von Claudin-1 und der verbreiterten Lokalisation von ZO-1. Gleichzeitig beeinflusste ZO-1 auch positiv die Ca2+-Konzentration im Stratum granulosum. Dieses Ergebnis spricht für eine regulative Aufgabe von ZO-1 innerhalb der Epidermis.

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