FAQ
© 2015 Staats- und Universitätsbibliothek
Hamburg, Carl von Ossietzky

Öffnungszeiten heute09.00 bis 24.00 Uhr alle Öffnungszeiten

Eingang zum Volltext in OPUS

Hinweis zum Urheberrecht

Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-68057
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2014/6805/


Selektion und Charakterisierung Selektin-spezifischer DNA-Aptamere

Faryammanesh, Rassa

pdf-Format:
 Dokument 1.pdf (3.398 KB) 


SWD-Schlagwörter: E-Selectin , Aptamer , HT29-Zelle , Endothel , Krebs , Metastase , Leukozytenemigration
Freie Schlagwörter (Deutsch): SELEX
Basisklassifikation: 35.70
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Hahn, Ulrich (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 23.05.2014
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 30.06.2014
Kurzfassung auf Deutsch: Zur Familie der Selektine gehören die Leukozyten- (L), Endothel- (E) und Platelet- (P) Selektine. Die physiologische Aufgabe von diesen Zell-Adhäsions-Glykoproteinen besteht in der Rekrutierung und Anhaftung von Leukozyten bei Entzündungsreaktionen und Immunantworten. Die, auf den Endothelzellen präsentierten, E- und P-Selektine sind für die Adhäsion von E- und P-Selektin-Ligand-präsentierenden Leukozyten an das Endothelium verantwortlich, während L-Selektin, welches nur auf Leukozyten präsentiert wird, die Interaktion von Leukozyten mit L-Selektin-Ligand-präsentierenden Zellen, wie zum Beispiel Endothelzellen, bewirkt. Die Beteiligung von Selektinen, besonders E- und P-Selektin, wurde bei verschiedenen Pathogenesen nachgewiesen. So spielen Selektine unter anderem bei der Entstehung von Thrombose, Arteriosklerose, Ischämie und rheumatoider Arthritis eine entscheidende Rolle. Zusätzlich leiten E- und P-Selektin die Adhäsion von Tumorzellen an das vaskuläre Endothelium ein, welches ein kritischer Schritt bei der Metastasierung ist. Dabei ahmen die Tumorzellen durch Produktion von Selektin-Liganden die Leukozyten nach und nutzen den Selektin-vermittelten Leukozytenmigrationsweg, um zu metastasieren.
In vivo Studien haben gezeigt, dass die Abwesenheit von E- und P-Selektin zu einer drastischen Reduzierung von Metastasen führt. Eine Möglichkeit, die Interaktion zwischen Selektinen und den, von Tumorzellen präsentierten, Selektin-Liganden zu unterbinden, böte der Einsatz von Aptameren. Dabei handelt es sich um kurze Nucleinsäuren, die aufgrund ihrer dreidimensionalen Struktur in der Lage sind, hochaffin und spezifisch an ihre Zielmoleküle zu binden. Die Bindung des Aptamers an das Zielprotein kann unter anderem zu dessen Inhibierung führen.
In dieser Arbeit wurden zwei DNA-Aptamere für E-Selektin, SDA1 und SDA2, in einem in vitro SELEX-Prozess (Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment) selektiert, mit dem Ziel, die Interaktion zwischen E-Selektin und E-Selektin-Ligand präsentierenden Zellen zu blockieren. Es konnte mittels Filter-Retentions-Assay gezeigt werden, dass beide 91 Nucleotid langen DNA-Aptamere mit einer Dissoziationskonstante von ca. 100 nM sowohl an E- als auch an P-Selektin binden. Auch die Bindung an murine Selektine konnte nachgewiesen werden. Der anti-adhäsive Effekt der Aptamere auf die Bindung zwischen E- und P-Selektin-Chimären und E- und P-Selektin-Ligand- (Sialyl-Lewis-X, Sialyl-Lewis-A) präsentierenden humanen Darm-Adenokarzinom-Grad-II-Zellen (HT29) wurde in einem statischen System mittels Durchflusszytometrie nachgewiesen. Ebenfalls wurde in einem dynamischen System in einem laminaren Fluss-Assay unter physiologischen Scher-Bedingungen die Interaktion zwischen immobilisierten E- bzw. P-Selektin-Chimären und HT29-Zellen bzw. humaner eosinophiler Leukämiezelllinie EOL-1 mittels SDA1 und SDA2 inhibiert. Die Stabilität der Aptamere in Voll-Medium für mehr als zwei Stunden ermöglichte die Untersuchungen in in vitro Zellkultur-Modellen. Somit wurde zum Schluss die Interaktion zwischen TNF--stimulierten, E-Selektin-präsentierenden human pulmonary microvascular endothelial cells (HPMECs) und HT29-Zellen unter Scher-Bedingungen in einem laminaren Fluss-Assay mittels SDA1 bzw. SDA2 blockiert.
Zusammengefasst wurden in dieser Arbeit zwei E- und P-Selektin-spezifische DNA-Aptamere selektiert, welche in der Lage sind unter physiologischen Scher-Bedingungen die Interaktion zwischen E- und P-Selektin und dessen Liganden zu inhibieren. SDA1 und SDA2 sind somit potentielle neue therapeutische Wirkstoffe, die eventuell zur Verminderung der Selektin-vermittelten Adhäsion von Tumorzellen während der Metastasierung führen können.
In zukünftigen Untersuchungen sollte die Wirkung der Aptamere in vivo mit Hilfe eines Xenotransplantat-Modells des menschlichen Pankreas-Adenokarzinoms überprüft werden. Diesbezüglich sollte auch an der Erhöhung der Stabilität von SDA1 und SDA2 gearbeitet werden.
Kurzfassung auf Englisch: Leukocyte (L), endothelial (E) and platelet (P) selectins are the three members of the selectin family. The physiological function of these cell adhesion glycoproteins is the recruitment and adherence of leukocytes in inflammatory and immune responses. Presented on the endothelial cells, E- and P- selectins are responsible for the adhesion of E- and P-selectin ligand-presenting leukocytes to the endothelium. L-selectin, which is present only on leukocytes, play a key role in the interaction of leukocytes with L-Selectin ligand presenting cells such as endothelial cells. The involvement of selectins, especially E- and P-selectin, has been demonstrated in various pathogeneses. Thus, selectins are among others responsible for the development of thrombosis, atherosclerosis, ischemia and rheumatoid arthritis. Additionally, E- and P-selectin conduct the adhesion of tumor cells to the vascular endothelium, which is a critical step in metastasis. The tumor cells mimic leukocytes by the production of selectin ligands and use the selectin-mediated migratory pathway of leukocytes to metastase.
In vivo studies have shown that the absence of E- and P-selectin leads to a drastic reduction of metastases. One way to prevent the interaction between selectins and selectin ligands by the tumor cells are aptamers. These are short nucleic acids with defined three-dimensional structures displaying high affinity and specificity for target molecules. The binding of aptamer to the target protein can have among others an inhibitory effect.
In this work, with the aim of blocking the interaction between E-selectin and E-selectin ligand presenting cells, two DNA aptamers called SDA1 and SDA2 were selected for E-selectin by using the in vitro SELEX-process (Systematic Evolution of Ligand by EXponential Enrichment). Via filter retention assay it could be shown that both 91 nucleotide long DNA aptamers are able to bind to E- and P-selectins with a dissociation constant of about 100 nM. Also the binding to murine selectins could be detected. The anti-adhesive effect of the aptamers on the interaction between E- and P-selectin chimera and E- and P-selectin ligand (sialyl Lewis X, sialyl Lewis A) presenting human colon adenocarcinoma grade II cells (HT29) has been shown in a static laminar flow adhesion assay. Also in dynamic laminar flow assays under physiological shear stress conditions the interaction between immobilized E- or P-selectin chimera and HT29 or human chronic eosinophilic leukemia cell line EOL-1 was inhibited by SDA1 and SDA2. The stability of the aptamers in full medium for more than two hours allowed the studies in in vitro cell culture models. In the end, the inhibitory effect of SDA1 and SDA2 on TNF- stimulated human pulmonary microvascular endothelial cells (HPMECs), which presented E-selectin and HT29 cells, was determined.
In summary, two E- and P-selectin specific DNA aptamers were selected in this work, which are able to inhibit the interaction between E- and P-selectin and its ligands under physiological shear conditions. SDA1 and SDA2 are potential new therapeutic agents that can lead to the suppression of selectin-mediated adhesion of tumor cells during metastasis.
In future studies, the effect of the aptamers should be validated in vivo by using a xenograft model of human pancreatic adenocarcinoma. In this regard, the stability of SDA1 and SDA2 should be increased.

Zugriffsstatistik

keine Statistikdaten vorhanden
Legende