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Titel: Molekulare Interaktionen des postsynaptischen Gerüstproteins IRSp53
Sprache: Deutsch
Autor*in: Gerhard, Yannick Daniel
Erscheinungsdatum: 2013
Tag der mündlichen Prüfung: 2014-05-23
Zusammenfassung: 
Das Insulinrezeptorsubstratprotein von 53kDa (IRSp53) übt eine Vielzahl verschiedener zellulärer Funktionen aus und ist u.a. beteiligt an der Entstehung von Membranausstülpungen. Als ein Multidomänenprotein rekrutiert es hierfür zum einen Aktin-regulatorische Proteine zum Ort der Membranausstülpung und ist gleichzeitig selbst in der Lage die Plasmamembran zu binden und zu verformen. Somit ist IRSp53 subzellulär
an der Plasmamembran lokalisiert und nimmt dort einen direkten Einfluss auf die Morphogenese der Zelle. Eines der Ziele dieser Arbeit war es, die Relevanz der vier IRSp53-Domänen für die Plasmamembranassoziation des Proteins zu untersuchen. Mittels Membranproteinextraktionen konnte gezeigt werden, dass IRSp53 hauptsächlich über seine IM-Domäne an die zelluläre Plasmamembran bindet. Die SH3-Domäne hingegen scheint die Membranassoziation des Proteins zu limitieren, da die funktionelle
Inaktivierung dieser Domäne zu einer deutlich stärkeren Anreicherung des Proteins an der Plasmamembran führte. Eine in der Literatur postulierte intramolekulare Interaktion zwischen der IM- und der SH3-Domäne könnte hierfür ursächlich sein und wurde im Rahmen dieser Arbeit mithilfe von Koimmunpräzipitationsstudien nachgewiesen. Eine
ebenfalls in der Literatur postulierte Interaktion zwischen der CRIB- und der SH3-Domäne konnte hingegen widerlegt werden.

Weiterhin wurde die Rolle von IRSp53 in neuronalen Zellen untersucht. Die in der postsynaptischen Dichte exzitatorischer Synapsen vorkommende IRSp53 S-Isoform besitzt eine Vielzahl von Protein-Interaktionsmöglichkeiten und nimmt somit Einfluss auf die Stabilität von NMDA- und AMPA-Rezeptoren in der postsynaptischen Membran. Zur Untersuchung des Einflusses von IRSp53 auf die Stabilität und Internalisierung dieser
Rezeptoren wurde in dieser Arbeit zunächst das System der Zelloberflächenbiotinylierung an primär kultivierten kortikalen Wildtypneuronen etabliert und in einem nächsten Schritt bei IRSp53-überexprimierenden Neuronen eingesetzt. Hierbei zeigte sich, dass eine
IRSp53-Überexpression die Internalisierung der NMDA-Rezeptoren signifikant steigert, während es die AMPA-Rezeptor-Internalisierung nicht beeinflusst. Diese Ergebnisse bekräftigen die Hypothese, dass IRSp53 die Stabilität von NMDA-Rezeptoren unter physiologischen Bedingungen einschränkt und die NMDA-Rezeptoren in Abwesenheit von
IRSp53 stabiler in der postsynaptischen Membran verankert sind. Die resultierende erhöhte Präsenz der NMDA-Rezeptoren an der postsynaptischen Membran könnte die Erklärung sein für die in der Literatur beschriebene erhöhte NMDA-Rezeptor-vermittelte synaptische
Transmission IRSp53-defizienter Mäuse. Dies könnte auch ein Grund für das extrem schlechte Abschneiden dieser Tiere in einfachen Lernexperimenten sein.

The insulin receptor substrate protein of 53 kDa (IRSp53) fulfills a multitude of different cellular functions and is for example involved in the formation of membrane protrusions. On the one hand, IRSp53 recruits actin-regulatory proteins to the place of membrane protrusions. On the other hand, it is itself able to bind and deform the membrane. Hence, IRSp53 is mainly localized at the plasma membrane and therefore influences the morphology of the cell. One of the aims of this thesis was to investigate which of the four
functional domains of IRSp53 is relevant for the association with the plasma membrane. By using membrane protein extractions I could show that IRSp53 mainly binds the cellular plasma membrane via its n-terminal IM-domain. However, the SH3-domain seems to limit the membrane association of IRSp53 under physiological conditions, as the functional inactivation of this domain results in a much stronger membrane association. An
intramolecular interaction between the IM- and the SH3-domain, which was postulated in the literature before, might be the cause of this and was confirmed in this thesis by coimmunoprecipitation assays. No evidence was found for an interaction of the CRIB- and SH3-domains which was hypothesized by some authors.

Furthermore, the role of IRSp53 in neuronal cells was investigated. The S isoform of IRSp53, which is present in the postsynaptic density of excitatory synapses, interacts with a variety of proteins and may thus influence the stability of NMDA- and AMPA-receptors in the postsynaptic membrane. Published data showed an increased abundance of NMDAreceptors
at the postsynaptic density as well as an increased NMDA-receptor mediated synaptic transmission in IRSp53 deficient mice that might facilitate the poor performance of these mice in simple learning tasks. To study the effect of IRSp53 on the internalization of NMDA and AMPA-receptors, the method of cell surface biotinylation on primary cortical neurons was established. Receptor internalization was investigated in cortical
neurons overexpressing IRSp53 using a recombinant adeno-associated viral gene delivery system. The results revealed an increase in NMDA-receptor internalization, whereas the AMPA-receptor internalization was unchanged. The outcome reinforces the hypothesis that IRSp53 limits the stability of NMDA-receptors and thus the loss of IRSp53 leads to a stabilization of NMDA-receptors at the postsynaptic membrane.
URL: https://ediss.sub.uni-hamburg.de/handle/ediss/5490
URN: urn:nbn:de:gbv:18-68403
Dokumenttyp: Dissertation
Betreuer*in: Kreienkamp, Hans-Jürgen (PD Dr.)
Enthalten in den Sammlungen:Elektronische Dissertationen und Habilitationen

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