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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-68581
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2014/6858/


Über den Einfluss von Reelin auf die Fortsatzdifferenzierung hippocampaler Neurone

Huber, Christiane Katia

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SWD-Schlagwörter: Reelin , Hippocampus , Nervenzelle , Axon
Freie Schlagwörter (Deutsch): Reelin , bipolar , Neuron , Migration , Fortsatz
Freie Schlagwörter (Englisch): reelin , bipolar , neurons , migration , process
Basisklassifikation: 42.15
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Förster, Eckart (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 03.06.2014
Erstellungsjahr: 2013
Publikationsdatum: 16.07.2014
Kurzfassung auf Deutsch: Das extrazelluläre Matrixprotein Reelin spielt bei neuronaler Migration, Fortsatzorientierung und Schichtenbildung des Neokortex sowie Hippocampus eine wichtige Rolle.
Reelin ist ein 3461 Aminosäuren langes Glycoprotein, dessen Gen 1995 entdeckt wurde. Die Deletion des Genes führt zum Phänotyp der Reeler-Maus, einer Variante der Hausmaus, die sich durch Koordinationsstörungen, Ataxie und Tremor auszeichnet.
Reelin wird in der frühen embryonalen Phase von sogenannten Cajal-Retzius-Zellen sezerniert. Diese Zellen befinden sich in der Marginalzone, einer zellarmen Schicht unterhalb der Pia. In der pränatalen und adulten Phase erfolgt die Sekretion hauptsächlich durch GABAerge Interneurone.
Bei Defekten der Reelin-Sekretion oder Störungen der Reelin-Signalkaskade kommt es zu schweren Störungen der Schichtenbildung, Abweichungen der korrekten Fortsatzorientierung und Fehlpositionierung der migrierenden Neurone.
Während der Embryogenese erfolgt die neuronale Migration im Kortex entlang von radialen Gliafasern oder mittels Somatranslokation in Richtung der Reelin-reichen Marginalzone. Während der Migration wird das biopolare Stadium, in dem die axodendritische Polaritätsachse festgelegt wird, durchlaufen (Barnes and Polleux, 2009): Bei Erreichen der intermediären Zone bilden die Neurone zwei Fortsätze aus, wobei ein Fortsatz in Richtung Pia weist und zum Dendriten differenziert wird (leading process) und ein Fortsatz in Richtung Ventrikulärzone (trailing process) weist und zum Axon differenziert wird.
Früher wurde angenommen, dass die axodendritische Polaritätsachse in vitro im multipolaren Stadium festgelegt wird (Dotti et al, 1988).
Durch eine neuere Klassifizierung der Fortsatzdifferenzierung konnte gezeigt werden, dass die axodendritische Polaritätsachse in vitro ebenfalls im bipolaren Stadium festgelegt wird (Calderon de Anda, 2008), ähnlich wie in vivo.
Im Rahmen der neuronalen Polarisierung treten Veränderungen der Zytoskelett-Dynamik auf, die eine Stabilisierung des leading process und erhöhte Beweglichkeit sowie Wachstum des trailing process bewirken.
Mittlerweile gibt es Hinweise darauf, dass die Stabilisierung des leading process über die Phosphorylierung eines Aktin bindenden Proteins, dem sog. n-Cofilin an Serinrest 3 vermittelt wird, wodurch die F-Aktindepolymerisierung herabgesetzt wird.
Im Kortex konnte anhand von Immunfärbungen (Chai et al., 2009) gezeigt werden, dass der piawärts gerichtete leading process bei Erreichen der Reelin-haltigen Marginalzone durch Phosphorylierung von n-Cofilin stabilisiert wird.
Auf Basis dieser Erkenntnisse wurden hippocampale Wildtyp-Dispersionskulturen von Ratten, die an Postnataltag 5 präpariert wurden (P5), nach 24 Stunden in vitro unterschiedlich lange (3min, 5min, 15min, 30min) mit rekombinantem Reelin oder Kontrollmedium stimuliert oder unbehandelt belassen.
Anhand von p-Cofilin-Immunfärbungen und anschließender Intensitätsmessungen der Immunfluoreszenz beider Fortsätze der bipolaren Neurone, die mit einem Antikörper gegen p-Cofilin und einem fluoreszengefärbtem Zweitantikörper gefärbt wurden, konnte abgeschätzt werden, inwieweit die n-Cofilin-Phosphorylierung durch die Reelin-Inkubation beeinflusst wurde.
Die bipolaren Neurone wurden entsprechend ihres p-Cofilin-Färbemusters in unterschiedliche Kategorien eingeteilt. Es fanden sich sowohl bipolare Neurone mit zwei Fortsätzen ähnlicher Intensität sowie bipolare Neurone mit zwei Fortsätzen unterschiedlicher Intensität.
Mithilfe einer vorher festgesetzten Intensitätsskala wurde eine Unterscheidung zwischen Zellen mit einem stark angefärbten Fortsatz und Zellen mit einem schwach angefärbten Fortsatz getroffen und der jeweilige Anteil dieser Zellen an einer Dispersionskultur ermittelt.
Zusätzlich wurde mithilfe der Lebendmikroskopie und 30minütigen Filmsequenzen der Reelin-Effekt auf die Fortsatzmobilität untersucht. Zudem wurden p-Cofilin-Immunfärbungen des Hippocampus von Gehirnschnitten verschiedener Altersstufen angefertigt.
Es zeigte sich, dass die Inkubation mit rekombinanten Reelin zu einer Zunahme des Anteils der bipolaren Neurone mit einem stark angefärbten Fortsatz führte. Die Dauer der Inkubation spielte dabei eine entscheidende Rolle; so fand sich das Maximum an Zellen mit einem stark angefärbten Fortsatz bei einer Inkubationsdauer von 30min. Die Ergebnisse lassen die Interpretation zu, dass der Vorgang der n-Cofilin-Phosphorylierung in den Fortsätzen polarisierter Neurone zum einen intrinsisch gesteuert wird, jedoch innerhalb von Minuten durch das extrazelluläre Matrixprotein Reelin beschleunigt werden kann.
Die bereits vorher durch intrinsische Mechanismen festgelegte, polarisierte Verteilung der n-Cofilin-Phosphorylierung wird dabei beibehalten.
Kurzfassung auf Englisch: The extracellular matrix protein reelin exerts important roles in neuronal migration, neuronal process orientation and cortical layer formation.
Reelin is a 3461-amino acid glycoprotein. The reelin encoding gene was identified in 1995. In the mouse, deletion of the reelin encoding gene results in the reeler phenotype, which is characterized by movement disorders, ataxia and tremor.
During cortical development reelin is expressed by so called Cajal-Retzius cells that are localized in the marginal zone (mz), a cell-poor layer beneath the pial surface. From embryonic day (E) 18 onward reelin is expressed by interneurons. Deficient reelin signaling leads to characteristic layering malformation in the cerebral cortex and also causes polarity defects of cortical neurons.
During development of the cerebral cortex newly generated neurons migrate towards the mz along the processes of radial glial cells and eventually reach their final positions by radial glia-independent soma translocation. Thus, cortical neurons acquire their characteristic bipolar axo-dendritic polarity during migration (Barnes and Polleux, 2009): Upon reaching the intermediate zone, the neurons adapt a characteristic bipolar morphology with a trailing process, pointing toward the ventricular zone and representing the axon, and a leading process oriented toward the mz.
In contrast, neurons in dissociated neuronal primary cultures in vitro undergo intrinsically controlled differentiation stages and acquire their axo-dendritic polarity in the multipolar stage (Dotti et al, 1988).
According to a recently adapted classification of differentiation stages, axo-dendritic polarity in vitro is also determined in the bipolar stage (Calderon de Anda, 2008).
Neuronal process specification is modulated by cytoskeletal dynamics resulting in stabilization of the leading process and increased mobility and growth of the trailing process.
Recent studies have shown that stabilization of the leading process is induced by serine3-phosphorylation of n-cofilin, an actin-depolymerizing protein that promotes disassembly of F-actin. Phosphorylation of n-cofilin renders it unable to depolymerize F-actin.
In immunostained cortical sections p-cofilin was found to be enriched in the leading processes of radially migrating neurons that reached the reelin containing mz, suggesting that stabilization of the leading process is induced by reelin dependent phosphorylation of n-cofilin (Chai et al., 2009).
For our studies, we treated dissociated hippocampal wild-type cultures from postnatal day (p) 5 rats after 24 hours in vitro with recombinant reelin or control medium for 3min, 5min, 15min and 30min, or left them untreated.
Based on p-cofilin-immunostaining with fluorescently labelled antibodies and immunofluorescence intensity measurements of both processes of bipolar neurons, we could estimate how n-cofilin-phosphorylation was influenced by reelin stimulation.
According to their p-cofilin staining pattern bipolar neurons were divided in different categories. Bipolar neurons with two processes of similar intensity as well as bipolar neurons with two processes of varying intensity were found.
Using a pre-established intensity scale, we could distinguish between neurons with a strongly stained process and neurons with a weakly stained process, and determined the percentage of the different categories in a dissociated cell culture.
In addition, live imaging was used to study the reelin effect on process mobility. We also prepared p-cofilin-immunostaining of hippocampal brain slices at different ages.
Incubation with recombinant reelin led to an increase in the proportion of bipolar neurons with a strongly stained process. The incubation period played an important role. The maximum of bipolar neurons with a strongly stained process was found after an incubation period of 30 min. Our findings suggest that n- cofilin-phosphorylation is regulated intrinsically but can be induced within minutes by the extracellular matrix protein reelin, while the intrinsically predetermined polarized distribution of n-cofilin phosphorylation is maintained.

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