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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-68877
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2014/6887/


Joint use of Small Angle X-ray Scattering with high resolution methods to study flexible biological macromolecules

Die Verwendung von Röntgen-Kleinwinkelstreuung mit hochauflösenden Methoden zur Analyse von flexiblen biologischen Makromolekülen

Tria, Giancarlo

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SWD-Schlagwörter: Röntgen-Kleinwinkelstreuung
Freie Schlagwörter (Deutsch): SAXS in Lösung , flexiblen biologischen Makromolekülen
Freie Schlagwörter (Englisch): SAXS in solution , flexible biological macromolecules
Basisklassifikation: 42.03
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Svergun, Dmitri I. (Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 25.04.2014
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 25.07.2014
Kurzfassung auf Englisch: Small-Angle X-ray Scattering (SAXS) in solution is an established technique for the structural characterization of biological macromolecules. SAXS allows one to study proteins, nucleic acids and their complexes in near physiological environments. Since no crystals are needed, structural responses to changes in experimental conditions such as temperature, pressure and chemical modifications can be addressed. Over the last decades, important improvements in data analysis methods have significantly increased the number of biological questions that can be answered using SAXS. The method is especially powerful in combination with other biophysical and biochemical techniques, and SAXS often plays one of the major roles in complicated structural as well as functional investigations using hybrid approaches. Recent developments made solution SAXS very useful for the studies of flexible systems such as intrinsically disordered proteins (IDPs) and multi-domain proteins with unstructured regions. For many systems, especially for large complexes, SAXS is the only structural technique directly assessing particle flexibility. A recently developed approach where flexible systems are represented by an ensemble of conformations rather than a single model (Ensemble Optimization Method (EOM), Bernado et al. 2007) allowed one to provide quantitative descriptions of macromolecular flexibility in solution. The ensemble approach implemented in several computer programs became widely used by the community, but its use revealed some limitations. These limitations include restricted range of applicability to different type of macromolecules (with different flexibility scenarios) and also potential over- or under-interpretation of the data. The present dissertation is aimed at enhancing the capabilities offered by SAXS in solution for flexible macromolecules. The improvements described in this work, mainly devoted to molecular modelling and data analysis, shall overcome many of the limitations encountered when SAXS is employed to assess flexibility. The concept of using an ensemble for the characterization of macromolecular motion has been here further exploited and broadened to complicated scenarios, so far inaccessible by the method. The implementation of a rapid and effective procedure to generate flexible fragments with a possibility to account for particle symmetry allows one to build adequate multi-subunit models particles. This makes SAXS suitable for quantitative characterization of challenging systems where disorder comes in combination with other protein features, e.g. point group symmetry. In another development, the ensemble representation has been extended to account for mixtures of different oligomeric states of a protein making it possible to study polydisperse solutions. Additionally, problems of potential over- or under-representations of the data, typical of the ensemble approaches, were addressed, and two new metrics, Rflex and Rcheck, are introduced. Here, Rflex is used as a measure of flexibility – based on the concept of entropy coming from the field of information communication – whereas Rcheck is employed as a control parameter to detect potential artifacts. For a more intuitive interpretation, these metrics are complemented by a detailed graphical representation providing a comprehensive description of the behavior of flexible particles in solution. These new capabilities are extensively described in this dissertation with a particular focus on the methodology as well as their application in structural studies that already profited from the prototypal implementation of the method (program EOM 2.0). At a more general level, this dissertation aims at encouraging the use of a hybrid approach as standard modus operandi in the field of structural biology where detailed atomic observations – offered by high resolution techniques – are synergistically combined with the overall picture offered by SAXS in solution.
Kurzfassung auf Deutsch: Röntgen-Kleinwinkelstreuung (SAXS, englisch: small-angle X-ray scattering) ist eine etablierte biophysikalische Methode zur strukturellen Charakterisierung von biologischen Makromolekülen in Lösung. Sie ermöglicht die Analyse von Proteinen, Nukleinsäuren so wie deren Komplexen unter nahezu physiologischen Bedingungen. Da kein Kristall benötigt wird, können strukturelle Antworten auf Veränderungen in den experimentellen Parametern wie Temperatur, Druck und chemische Modifikationen untersucht werden. Während der letzten Dekaden haben wichtige Verbesserungen in den Methoden zur Datenanalyse die Reichweite der biologischen Fragestellungen, die mit SAXS beantwortet werden können, signifikant erhöht. Vor allem in Kombination mit anderen biophysikalischen und biochemischen Techniken stellt SAXS eine besonders leistungstarke Methode dar und wird demnach als essenziell für die Durchführung komplizierter struktureller sowie funktioneller Studien mittels hybrider Ansätze betrachtet. Des weiteren ist SAXS in Lösung besonders geeignet zur Untersuchung von flexiblen Systemen wie intrinsisch ungeordneten Proteinen (IDPs, englisch: intrinsically disordered proteins) und Proteinen, die aus mehren Domänen bestehen und unstrukturierte Regionen aufweisen. Für viele Systeme, insbesonders sehr grosse Komplexe, stellt SAXS die einzige Möglichkeit dar, die Flexibilität des Partikels zu analysieren. Mittels eines vor Kurzem entwickelter Ansatzes, mit der die Bewegung des Proteins durch ein Ensemble von Konformationen anstatt eines einzelnen Modells dargestellt wird (Ensemble Optimization Method (EOM), Bernado et al. 2007), erhält man eine quantitative Beschreibung der makromolekularen Flexibilität in Lösung. Dieser in einigen Computerprogrammen implementierte Ensemble-Ansatz wurde von der Gemeinschaft der SAXS Benutzern umfangreich verwendet. Sein Gebrauch hat, jedoch, einige Grenzen offenbart. Diese Grenzen beinhalten ein eingeschränkter Geltungsbereich für unterschiedliche Arten von Makromolekülen (für Szenarien mit unterschiedlicher Flexibilität) so wie die potentielle Fehlinterpretation der Daten. Das Ziel der vorliegenden Dissertation besteht darin, das Anwendungsspektrum von SAXS zur Untersuchung von flexiblen Makromolekülen in Lösung auszuweiten. Die hier vorgestellten Verbesserungen, vornehmlich der molekularen Modellierung und Datenanalyse gewidmet, sollen dazu beitragen, die praktischen Einschränkungen zu überwinden, auf die man bei der Anwendung von SAXS zur Untersuchung von Flexibilität stöβt. Das Konzept der Anwendung eines Ensembles zur Charakterisierung der makromolekularen Bewegung wurde hier weiter ausgeschöpft und auf solche kompliziertere Szenarien ausgeweitet, die dieser Methode bislang nicht zugänglich waren. Die Implementation einer schnellen und effektiven Prozedur zur Generierung von flexiblen Fragmenten mit der Möglichkeit die Symmetrie des Partikels zu berücksichtigen, ermöglicht die Rekonstruktion adequater Modelle von Partikel mit mehreren Domänen. Dadurch kann SAXS auch zur qualitativen Charakterisierung herausfordernder Systeme angwendet werden, die sowohl Fehlordnung als auch andere Merkmale wie Punktgruppen-Symmetrie auweisen. In einer anderen Entwicklung wurde die Ensemble-Methode auch auf Mixturen von Volllängen Proteinen ausgeweitet und ermöglicht so, die Analyse von polydispersen Lösungen. Zusätzlich wurden Probleme mit Über- bzw. der Unterrepräsentationen, die typischerweise bei diesem Ansatz auftreten, in Angriff genommen und zwei neue metrische Maße, Rflex und Rcheck, werden eingeführt. Dabei wird Rflex – basierend auf dem Entropie-Konzept aus dem Fachbereich der Informations- und Kommunikationstechnologie – benutzt, um die Flexibilität zu messen, wobei Rcheck als Kontrollparameter zur Detektion potenzieller Artefakte angewendet wird. Für eine intuitivere Interpretation der Ergebnisse werden diese metrischen Maße mit einer detaillierten graphischen Repräsentation komplementiert, um eine umfassende Beschreibung des Verhaltens der flexiblen Partikel in Lösung zu erhalten. Diese neuen Einsatzmöglichkeiten werden extensiv in dieser Dissertation beschrieben. Dabei wird insbesondere auf die Methologie sowie ihre Anwendung in Struktur-/Funktionsstudien eingegangen, die bereits von der prototypischen Implementierung der Methode in das Programm EOM 2.0 profitiert haben. Auf einer allgemeineren Ebene soll diese Dissertation dazu anregen, den beschriebenen Hybrid-Ansatz als Standard modus operandi in der Strukturbiologie zu verwenden, um detaillierte atomare Beobachtungen – verfügbar durch hochaufgelöste Strukturbestimmungsmethoden – synergetisch mit dem Einblick in das „große Ganze“ – verfügbar durch SAXS in Lösung – zu kombinieren.

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