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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-69061
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2014/6906/


Die Rolle des Spine Apparates als Kalzium-Speicher während der synaptischen Transmission : Kombination von Zwei-Photonen Kalzium-Imaging mit Glutamat-Uncaging an individuellen Synapsen in organotypischen Schnittkulturen

Tippmann, Anja

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SWD-Schlagwörter: Nervenzelle , Calcium , Synapse , Hippocampus , Synaptische Transmission , Mikroskopie , Zweiphotonenabsorption
Freie Schlagwörter (Deutsch): Gewebekultur , Mooszelle , Spine Apparat , Synaptopodin , Spine
Freie Schlagwörter (Englisch): slice culture, mossy cell , spine apparatus , synaptopodin , spine
Basisklassifikation: 42.15 , 42.17
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Frotscher, Michael (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 04.07.2014
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 14.08.2014
Kurzfassung auf Deutsch: Im Allgemeinen wird angenommen, dass Veränderungen der freien Kalzium-Konzentration im Zytoplasma eine Verbindung zwischen synaptischer Erregung und den intrazellulären Prozessen zur Ausbildung von synaptischer Plastizität darstellen. Postsynaptische Kalzium-Speicher können dabei die Kinetik solcher Kalzium-Veränderungen regulieren. Dendritische Spines bzw. Excrescencen der CA3-Pyramidenzellen und Mooszellen im Hilus des Gyrus dentatus enthalten den sogenannten Spine Apparat, der die Rolle eines solchen Kalzium-Speichers übernehmen kann. Diese spezielle Organelle setzt sich aus Zisternen des glatten endoplasmatischen Retikulums und dazwischen liegenden elektronendichten Platten zusammen. Mit dem Spine Apparat ist das Aktin-bindende Protein Synaptopodin assoziiert. In Synaptopodin-Knock-out Mäusen werden, bei ansonsten unveränderter Morphologie der Neurone, keine Spine Apparate ausgebildet. Dies geht mit einer reduzierten Langzeit-potenzierung an der Synapse zwischen CA3- und CA1-Pyramidenzellen und einer beeinträchtigten räumlichen Lern-Leistungen einher.
In dieser Arbeit sollte nun untersucht werden, ob der Spine Apparat an der Kalzium-Dynamik während der synaptischen Transmission beteiligt ist. Dazu wurden Kalzium-Transienten in Excrescencen der Mooszellen in organotypischen Schnittkulturen von Wildtyp und Synaptopodin-Knock-out Mäusen miteinander verglichen. Für die Experimente wurden die Patch-Clamp-Technik mit der Zwei-Photonen-Mikroskopie und der optischen Freisetzung von Glutamat (Zwei-Photonen-Uncaging) kombiniert. Durch die lokale Freisetzung des Neurotransmitters konnte eine direkte Korrelation zwischen den induzierten exzitatorischen postsynaptischen Ereignissen und den gleichzeitig resultierenden Kalzium-Veränderungen an individuellen Synapsen der Mooszellen hergestellt werden.
In den hier durchgeführten Experimenten wurde eine erhebliche Heterogenität der induzierten Signale in beiden Genotypen gefunden. Die Amplituden der exzitatorischen postsynaptischen Ströme und Potentiale und auch der Kalzium-Transienten zeigten von Synapse zu Synapse eine hohe Varianz. Bei dem Vergleich der ermittelten Signale zwischen Synaptopodin-Knock-out und Wildtyp konnte kein Unterschied gefunden werden. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass der Spine Apparat während der basalen synaptischen Transmission keine Rolle als zusätzliche Kalzium-Quelle spielt. Durch die pharmakologische Blockade der N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptoren konnte außerdem gezeigt werden, dass der Einstrom durch diese Kanäle die Hauptquelle für synaptisch induzierte Kalzium-Transienten darstellt.
Des Weiteren wurden die Kalzium-Transienten während einer starken Stimulation der Moosfaser-Synapse verglichen, die zur Induktion von synaptischer Plastizität führen kann. Dazu wurden durch Uncaging induzierte exzitatorische postsynaptische Potentiale und in die Zelle zurückpropagierende Aktionspotentiale miteinander kombiniert. Unter diesen Bedingungen konnte ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Genotypen festgestellt werden. So waren die mittleren Kalzium-Transienten im Synaptopodin-Knock-out um etwa 25 % in ihrer Amplitude im Vergleich zum Wildtyp reduziert. Schlussfolgernd lässt sich sagen, dass während erhöhter synaptischer Transmission der Spine Apparat als zusätzliche Kalzium-Quelle in dendritischen Spines dient.
Durch diese Arbeit konnte ein erster direkter Hinweis gegeben werden, dass der Spine Apparat die Rolle eines intrazellulären Kalzium-Speichers und Regulators der Kalzium-Konzentration im Spine innehat.
Kurzfassung auf Englisch: Generally, it is assumed that transient changes in the concentration of free cytoplasmic Ca2+ in dendritic spines link synaptic excitation to intracellular mechanisms underlying synaptic plasticity. Postsynaptic Ca2+ stores potentially can regulate the kinetics of these Ca2+ transients. It has been suggested that the so called spine apparatus, a structurally refined derivative of the endoplasmic reticulum, presents such a Ca2+ store in dendritic spines. This special organelle consists of flat cisterns of smooth endoplasmic reticulum with intervening electron dense plates. The large complex spines or thorny excrescences of hilar mossy cells and CA3 pyramidal neurons contacted by the hippocampal mossy fibers typically contain a spine apparatus. Together with the spine apparatus the actin-binding protein Synaptopodin is closely associated. Previously it was found that mutant mice lacking Synaptopodin fail to develop spine apparatuses in otherwise unchanged dendritic spines. The absence of Synaptopodin is also accompanied by a reduced long term potentiation at the hippocampal CA3-CA1 synapse and an impaired spatial learning performance.
In this study, the hypothesis that the spine apparatus contributes to Ca2+ kinetics during synaptic transmission should be tested. For this purpose Ca2+ transients in large complex spines of mossy cells in entorhino-hippocampal organotypic slice cultures of wild type mice and Synaptopodin knockout mice were compared with each other. In these experiments, the patch-clamp technique with two-photon Ca2+ imaging and two-photon glutamate uncaging were combined. Local photolysis of the caged compound MNI (4-methoxy-7-nitroindolinyl)-glutamate allowed the correlation between the induced excitatory postsynaptic events and the corresponding Ca2+ changes at individual synapses of hilar mossy cells.
In the experiments performed here, a remarkable heterogeneity among the elicited signals in complex spines in both wild type tissue and Synaptopodin knockout tissue were found. The amplitudes of the elicited excitatory postsynaptic events as well as Ca2+ transients varied largely from synapse to synapse. The comparison of the detected signals between wild type and knockout revealed no difference. It can therefore be concluded that during the basal synaptic transmission the spine apparatus is not involved in calcium kinetics in spines or serves as an additional calcium store. However, induced Ca2+ transients were blocked by the N-methyl D-aspartate (NMDA) receptor antagonist D-AP5, indicating that Ca2+ influx through the NMDA receptor is essential for synaptically evoked Ca2+ transients in large complex spines.
In further experiments, calcium transients during strong stimulation of the mossy fiber synapse were examined, which will lead to the induction of synaptic plasticity. For this reason the combination of excitatory postsynaptic potentials evoked by glutamate uncaging with backpropagating action potentials were used. Under these conditions, a significant difference between Synaptopodin-knockout and wild type organotypic slice cultures has been proven. The averaged calcium transients in the knockout showed a reduction in there mean amplitude of 25 % in comparison with the wild type. Therefore it can be concluded that during increased synaptic transmission the spine apparatus indeed plays a role as additional calcium source in dendritic spines.
The present study will be the first direct indication that the spine apparatus serves as an intracellular calcium store and is involved in the regulation of calcium kinetics in the dendritic spines.

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