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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-69166
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2014/6916/


Selective modulation of PML nuclear bodies by Adenovirus regulatory proteins

Selektive Modulation von PML Nuclear Bodies durch adenovirale Regulatorproteine

Berscheminski, Julia

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SWD-Schlagwörter: Sumo , PML
Freie Schlagwörter (Deutsch): Sp100 , Adenovirus
Basisklassifikation: 42.32
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Dobner, Thomas (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 14.03.2014
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 08.08.2014
Kurzfassung auf Deutsch: PML Kerndomänen (PML-NBs) sind Matrix-gebundene, nukleäre Strukturen, die mit einer Vielzahl von Funktionen, einschließlich DNA Reparatur, transkriptionelle Regulation, Proteinabbau und Tumorsuppression verbunden sind. Diese Multiproteinkomplexe spielen außerdem eine essentielle Rolle bei der antiviralen Immunabwehr der Wirtszelle, welche durch Akkumulation von SUMO-abhängigen und Interferon-induzierten Wirtsfaktoren vermittelt wird. Um solchen immunmodulatorischen Vorgängen entgegenzuwirken, werden PML-NBs von zahlreichen viralen Regulatorproteinen manipuliert. Paradoxerweise dazu assoziieren hauptsächlich DNA-Virusgenome an den PML-NBs und virale Transkriptions-/Replikationszentren werden folglich in ihrer Nähe initiiert.
Da für einige Ad Regulatorproteine bereits eine enge Assoziation mit den PML-NBs beschrieben wurde, wird eine entscheidende Rolle dieser Kerndomänen im Ad Lebenszyklus vermutet, wobei die funktionellen Konsequenzen dieser Wechselwirkungen weitgehend unbekannt sind. Das frühe Ad5 Regulatorprotein E1B-55K scheint dabei einen zentralen Faktor darzustellen, da bereits SUMO-abhängige, funktionelle Interaktionen mit verschiedenen PML-NB-assoziierten Wirtsfaktoren beobachtet wurden. Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung der feinregulierten Wechselwirkungen zwischen Ad Regulatorproteinen und Komponenten der zellulären PML-NBs, um das Verständnis dieser Wirtsstrukturen bezüglich ihrer Rolle in der Ad5 Infektion zu erweitern.
Im ersten Teil der Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Ad5 Haupttransaktivator E1A-13S an den PML-NBs lokalisiert. Koimmunopräzipitationsexperimente belegten, dass E1A-13S bevorzugt mit PML-II, einer von mindesten sechs nukleären Isoformen des humanen PML Proteins interagiert. Genau diese PML-II Isoform ist ebenfalls an der Ad induzierten Umlokalisierung von PML-NBs in elongierte, fibrilläre Strukturen, den sogenannten PML track-like structures, beteiligt. Mit Hilfe von Deletionsmutanten konnte der Interaktionsbereich mit PML-II innerhalb der CR3 (conserved region 3) Region von E1A-13S lokalisiert werden. Diese Region im adenoviralen Protein wurde zuvor bereits als Bindestelle für zahlreiche andere Transkriptionsfaktoren beschrieben. Tatsächlich verstärkte die Kooperation mit PML-II die E1A-13S-vermittelte Aktivierung der zellulären sowie adenoviralen Transkription. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass PML-II im Gegensatz zur zunächst postulierten antiviralen Funktion der PML-NBs, die virale Genexpression humaner Adenoviren positiv beeinflusst.
Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Rolle des PML-NB-assoziierten, Transkriptionsfaktors Sp100 während der produktiven Ad5 Infektion. Die Abwesenheit von Sp100 mittels RNAi-basierten Techniken führte zur verstärkten Ad Replikation und zur gesteigerten viralen Genexpression. Die Sp100-vermittelte Repression der Virusvermehrung zeigte sich abhängig von der Expression der Sp100 Isoformen B, C und HMG, welche die virale Genexpression bereits auf der Transkriptionsebene inhibierten. Im Gegensatz dazu aktivierte Sp100A die Transkription von viralen und zellulären Promotoren in Reportergenversuchen.
Basierend auf den erhobenen Befunden nehmen wir an, dass humane Adenoviren der Sp100-vermittelten Restriktion entgegenwirken, um die effiziente virale Replikation sicherzustellen. Einerseits konnte eine Ad5-vermittelte Umlokalisierung von Sp100B, C und HMG von den PML-NBs weg beobachtet werden, wohingegen Sp100A an den PML track-like structures zurückgehalten wird, welche die neugebildeten viralen Replikationszentren, und somit die Orte der aktiven viralen Transkription darstellen. Der zusätzlich nachgewiesene Virus-induzierte Verlust der Sp100 SUMOylierung scheint einen weiteren Teil des viralen Repertoires zur Hemmung der intrinsischen Immunität darzustellen. Weitere Daten zeigen, dass die DeSUMOylierung von Sp100 zur verminderten Assoziation mit dem Heterochromatinprotein 1 (HP1) führt und vermutlich die Kondensation von Chromatin einschränkt. Zusätzliche Ergebnisse zeigen außerdem, dass E1B-55K mittels seiner C-terminalen Domäne in Abhängigkeit der eigenen SUMO Modifikation nur mit Sp100A interagiert, was zur Rekrutierung von Sp100A zu den PML-NBs führt.
Zusammengefasst liefert diese Arbeit wichtige Hinweise dafür, dass Ad antiviralen Immunantworten selektiv entgegenwirkt und gleichzeitig von proviralen PML-NB-assoziierten Transkriptionsfaktoren profitiert, indem positive Faktoren aktiv zu den PML track-like structures rekrutiert werden, um ein provirales Umfeld zur effizienten Genexpression an diesen nukleären Subdomänen zu schaffen.
Kurzfassung auf Englisch: PML nuclear bodies (NBs) are matrix-bound nuclear structures that have been implicated in a variety of functions, including DNA repair, transcriptional regulation, protein degradation, and tumor suppression. These domains are also known to play an essential role in antiviral host-cell defense, most presumably mediated via accumulation of SUMO-dependent and interferon-induced antiviral host factors. This likely explains why they are targeted and subsequently manipulated by numerous viral regulatory proteins. Paradoxically, the genomes of numerous DNA viruses become associated with PML-NBs, and initial sites of viral transcription/replication are often juxtaposed to these domains. To date several Ad regulatory proteins have shown association with PML-NBs, illustrating their crucial role during Ad infection, although the functional consequences of this association are still largely elusive. Particularly, the early adenoviral regulator E1B-55K has been shown to cooperate with various PML-NB-associated host factors in a SUMO-dependent manner. The aim of this work was to further elucidate the interplay between Ad regulatory proteins and PML-NBs, to unravel the enigma of these nuclear structures with respect to their role during Ad5 infection.
The first part of this work shows that the major adenoviral transactivator protein E1A-13S targets PML-NBs. Co-immunoprecipitation assays revealed that E1A-13S preferentially interacts with only one of at least six nuclear human PML isoforms, namely PML-II, which is also essential for Ad5 induced relocalization of PML-NBs into so called track-like structures. Deletion mapping located the interaction site within the E1A CR3, previously described as the transcription factor-binding region of E1A-13S. Indeed, cooperation with PML-II enhanced E1A-13S-mediated transcriptional activation. These results suggest that contrary to PML-NB-associated anti-viral defense, PML-II may support transactivation of viral gene expression.
The second part of this work unravels the role of the PML-NB-associated, alternatively spliced transcriptional regulator Sp100 during productive Ad5 infection. Knockdown of Sp100 using RNAi techniques resulted in significantly increased Ad replication, including enhanced viral gene expression. Sp100-mediated restriction of Ad growth proved to be dependent on the expression of Sp100 isoforms B, C and HMG, repressing viral gene expression at the transcriptional level. However, the Sp100A isoform enhanced transcription from viral and cellular promoters in luciferase-reporter assays. To ensure efficient viral replication, Ad has apparently evolved strategies to antagonize Sp100-mediated restriction by alternative mechanisms. Ad5 induces relocalization of Sp100 B, C and HMG from PML-NBs, whereas Sp100A is kept in the PML tracks, which surround the newly formed viral replication centers as designated sites of active transcription. Ad-dependent loss of Sp100 SUMOylation is another crucial aspect of the virus repertoire to counteract intrinsic immunity by abrogating Sp100 association with the Heterochromatin protein 1 (HP1), likely limiting chromatin condensation. Additional data illustrate that E1B-55K interacts only with Sp100A via the C-terminal domain of E1B-55K in a SUMO-dependent manner, presumably causing the recruitment of Sp100A to PML-NBs.
Together this work provides evidence that Ad selectively counteracts antiviral responses, and at the same time benefits from proviral PML-NB-associated components by actively recruiting them to PML track-like structures, thereby creating a positive microenvironment for viral transcription and replication at these nuclear subdomains.

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