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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-69406
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2014/6940/


Die Interaktion zwischen dem zellulären Prion‐Protein und Aβ‐Oligomeren in der Alzheimer‐Erkrankung

Dohler, Frank

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Freie Schlagwörter (Deutsch): zelluläres Prion Protein , Alzheimer , Abeta-Oligomere , Protein Interaktion
Basisklassifikation: 42.13
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Glatzel, Markus (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 27.06.2014
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 26.08.2014
Kurzfassung auf Deutsch: Bei fehlerhafter Faltung, können Proteine toxische Eigenschaften erlangen und mit anderen Proteinen zu Aggregaten verklumpen.
Die Aggregate können sich in verschiedenen Organsystemen ablagern und so zu Funktionsstörungen bis hin zum Funktionsverlust von Organen führen. Auf diesem Prozess basieren viele neurodegenerative Erkrankungen wie z.B. die Lewy-Body Demenz, die transmissiblen
spongiformen Enzephalopathien und die Alzheimer-Erkrankung (AD). Trotz der unterschiedlichen Proteine, die von einer Fehlfaltung bei diesen verschiedenen Krankheitsbildern betroffen sind, wird ein gemeinsamer Mechanismus vermutet.
So konnten Laurén und Mitarbeiter im Jahr 2009 einen lang vermuteten Zusammenhang zwischen Prionenerkrankungen und der AD bestätigen, indem sie Beweise für eine direkte und hochaffine Interaktion zwischen dem zellulären Prion Protein (PrPC) und β-
Amyloid Oligomeren (Aβo) erbrachten.
Seitdem fokussieren sich zahlreiche Studien auf die Klärung molekularer Grundlagen und Mechanismen, die bei der Vermittlung der toxischen Effekte ausschlaggebend sein könnten. Interessanterweise basiert ein Großteil des derzeitigen Verständnisses der Interaktion auf Ergebnissen, die unter Verwendung von synthetischen Aβ-Präparationen und transgenen Mausmodellen zur Alzheimer-Erkrankung produziert wurden. Wenig ist über die molekularen Grundlagen beim Menschen in vivo bekannt. Im Rahmen dieser
Arbeit konnten wichtige Erkenntnisse zum Verständnis der Interaktion zwischen Aβo und PrPC gewonnen werden. Durch Co-Immunopräzipitation konnte an einer großen Kohorte
von Alzheimer- und Kontrollpatienten gezeigt werden, dass die Interaktion zwischen PrPC und Aβo nur in Gehirnen der Alzheimer-Patienten zu detektieren ist. Die Analyse von genetischen Risikofaktoren für die Alzheimer-Erkrankung, wie ApoE4 und PRNP
M129V Polymorphismus konnte keinen Einfluss dieser Parameter in Bezug auf die Interaktion herstellen. Auf Proteinebene konnte gezeigt werden, dass die Interaktion eine direkte Funktion der Aβ-Konzentration ist und unabhängig der Prion-Expression im
frontalen Kortex entsteht. Durch die erfolgreiche Etablierung eines neuartigen Aβ-PrPC Interaktions-Assays (APIA) konnte die Interaktion durch Verwendung von rekombinant exprimierten humanen PrPC mit Präparationen von sAβ42-Oligomeren erneut bestätigt werden. Durch die Verwendung einer N-terminalen Deletion des Prion Proteins wurde
ebenso die Notwendigkeit des flexiblen N-Terminus von PrPC bestätigt. Die Interaktion ist dabei hochspezifisch. So konnte durch die Verwendung eines oligomerspezifischen Antikörpers die Bindung von Aβ-Oligomeren an humanes rPrPC inhibiert werden. Die
Bindung von PrPC erfolgt nur bei gealterten Präparationen des synthetischen Aβ42-Peptids. Monomere Aβ42-Präparationen, sowie Aβ-Peptide anderer Länge wie Aβ38, Aβ40 und Aβ43 zeigen keine Bindung an das immobilisierte Prion Protein im Interaktionsassay. Fraktionierung der sAβ42-Präparationen durch Gelfiltration und die
anschließende Analyse der eluierten Fraktionen via APIA führten letztendlich zur Identifizierung der mit PrPC interagierenden sAβ-Oligomer Spezies. Diese besitzen ein Molekulargewicht (Mw) von 8 bis 21 kDa, was einer dimeren bis pentameren Aβ-
Aggregationsform entspricht. Das rekombinante PrPC konnte über sein C-terminal anfusioniertes Tag kovalent an Alexa Fluor® 488 Reporterchromophore gekoppelt werden. So wurde auch erfolgreich ein modifizierter Dot-Blot Overlay Assay etabliert, der die qualitative und semi-quantitative Charaktierisierung der Interaktion bei Verwendung
mit sAβ42 ermöglichte. Die Interaktion konnte auch in humanen Aβ42 Präparationen Durch die Verwendung von Homogenaten aus frontalen Kortices von AD-Patienten bestätigt werden. Auch in diesem Assay-Format konnte die Interaktion nicht in Kontrollgehirnen nachgewiesen werden. Die stärkste Bindung wurde in den unlöslichen P2-Fraktionen der AD-Patienten detektiert. Hierbei wurde zum ersten Mal die
Notwendigkeit der PrPC N-terminal lokalisierten Bindestellen zur Vermittlung der Interaktion zwischen humanem Prion Protein und humanen Aβ-Oligomeren nachgewiesen. Die Spezifität der Interaktion ließ sich durch die Verwendung des oligomerspezifischen Antikörpers A11 beweisen. Durch Kombination von Größenausschlusschromatographie mit APIA wurde die bindende Aβ-Oligomer Spezies in menschlichen Gehirnen identifiziert. Interessanterweise zeigen diese im Vergleich zu sAβ42 ein hohes Molekulargewicht im Bereich von >156 kDa – 300 kDa. Die Vermutung
es handelt sich wahrscheinlich um einen ternären Komplex von Aβ-Oligomeren mit assoziierten Proteinen konnte bisher nicht bestätigt werden. Möglicherweise handelt es sich somit um eine größere oligomere-Spezies von Aβ.

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