Discovery of protein biomarker predictive for the response to FOLFOX therapy in colorectal cancer

Abstract

Seit der Einführung der Chemotherapie zur Krebsbehandlung im frühen 20. Jahrhundert wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, die Effizienz von Medikamenten zu maximieren und gleichzeitig Nebenwirkungen zu minimieren. Ein detailliertes und umfassendes Verständnis von Mechanismen der Resistenz gegen Medikamente ist wichtig, um letztlich eine molekular basierte personalisierte Krebs- Therapie durchführen zu können. Da es eine große Variabilität im Ansprechen auf eine Chemotherapie gibt, ist die Entwicklung von prädiktiven Biomarkern für die Vorhersage eines Ansprechens auf eine Chemotherapie ein ehrgeiziges Ziel für das rasch wachsende Forschungsgebiet der personalisierten, molekularen Medizin. Die individuelle Vorhersage des Ansprechens auf eine Therapie wird die Behandlung von Patienten erheblich verbessern und somit das Überleben und die Lebensqualität der Patienten erhöhen. Das Ziel dieser Arbeit war daher, die Entdeckung von Protein Biomarker Kandidaten, die ein Ansprechen oder eine Resistenz gegen die FOLFOX Chemotherapie bei Dickdarmkrebs vorhersagen können. Die erste Aufgabe dieser Arbeit war die Zusammenstellung eines vielfältigen Panels von zwanzig kolorektalen Zellkulturen, bestehend aus primären, epithelialen Mischkulturen, primären klonalen Zelllinien sowie sekundären Zelllinien. Sechs primäre Mischkulturen und vier primäre, klonale Zelllinien wurden aus Tumoren von Patienten aufgearbeitet. Die zwanzig Zellkulturen wurden hinsichtlich ihrer Chemosensitivität gegenüber einer FOLFOX Behandlung untersucht. Zusätzlich wurde der Mutations-Status von ausgewählten Genen erhoben. Um prädiktive Protein Biomarker Kandidaten zu entdecken, wurden basale Protein Expressions Profile von den chemosensitiven und chemoresistenten Zellkulturen gemessen und verglichen. Hierfür wurde ein auf Massenspektrometrie basierter Top Down Proteomik Workflow für die Analyse des niedermolekularenProteoms neu entwickelt und validiert. Das hochmolekulare Proteom wurde mit einem Bottom Up Proteomic Workflow analysiert. Als Ergebnis beider Studien wurden mehrere Biomarker Kandidaten entdeckt, die differentiell reguliert zwischen der chemosensitiven und chemoresistenten Gruppe an Zellkulturen vorlagen. Die sechs aussichtsreichsten, hoch interessanten Biomarker Kandidaten wurden technisch validiert und angemessene technische Methode für den Nachweis der Biomarker Kandidaten in klinischen Proben wurde entwickelt. Diese Methode ist die Basis für eine Validierung der Biomarker Kandidaten in einer unabhängigen, klinisch relevanten Kohorte von Patienten. Zu den aussichtsreichsten Biomarker Kandidaten gehörte die SOD 1, ein Enzym, das an der Entgiftung von reaktiven Sauerstoffspezies beteiligt ist. Der biologische Hintergrund dieses Biomarker Kandidaten wurde exemplarisch untersucht. Hierbei wurde getestet, ob die Expression des Biomarker Kandidaten mit seiner Enzym-Aktivität korreliert. Darüber hinaus wurden nachgeschaltete Signalwege, mit Bezug auf die SOD 1 analysiert. Im Rahmen dieser Dissertation wurden prädiktive Biomarker Kandidaten für ein Ansprechen eine FOLFOX Chemotherapie identifiziert. Hierzu wurde ein Panel von selbst etablierten und sekundären Zellkulturen benutzt. Weiterhin wurde zur Untersuchung des Proteoms, ein Workflow neu etabliert und mit einem bestehenden Workflow kombiniert. Es ist weiterhin geplant, die gefundenen, vielversprechenden Biomarker Kandidaten und Kombinationen derer, mithilfe einer großen, heterogenen Gruppen zu validieren, um eine eventuelle klinische Anwendung in der Zukunft zu überprüfen.

Since the introduction of chemotherapy for cancer treatment in the early 20th century, considerable efforts have been made to maximize drug efficiency and at the same time minimize side effects. A detailed and comprehensive understanding of drug response mechanisms is essential to ultimately guide a molecular based personalized anticancer therapy. As there is a great interpatient variability in response to chemotherapy, the development of predictive biomarker for the response to chemotherapy is an ambitious aim for the rapidly growing research area of personalized molecular medicine. The individual prediction of response will greatly improve treatment and thus increase survival and life quality of patients. Towards this end, this thesis aimed at the discovery of protein biomarker candidates predictive for the response to FOLFOX chemotherapy in colorectal cancer. The first task of this thesis was the assembly of a diverse panel of twenty colorectal cell cultures, consisting of primary, epithelial mixed cultures, primary clonal cell lines, as well as secondary cell lines. Six primary mixed cultures and four primary, clonal cell lines were established from patients tumors. The cell culture panel was characterized in respect to chemosensitivity to FOLFOX treatment and mutation status of selected genes. In order to discover predictive protein biomarker candidates, basal protein expression profiles of chemosensitive and chemoresistant cell cultures were measured and compared. Therefore, a Top Down proteomic workflow for the analysis of the low molecular weight proteome was newly established and validated. The high molecular weight proteome was analyzed using a Bottom Up proteomic workflow. In combination, these workflows revealed several biomarker candidates, differentially regulated between the chemosensitive and chemoresistant cell cultures. The six most promising biomarker candidates were technically validated and adequate assays for the detection of the biomarker candidates in clinical samples were developed. These assays are the basis for a validation of biomarker candidates in an independent, clinically relevant, cohort of patients. One of the most promising biomarker candidates was the SOD 1, an enzyme involved in the detoxification of reactive oxygen species. The biological background of this biomarker candidate was exemplarily further investigated. Therein, it was tested whether the expression of the biomarker candidate correlates with enzyme activity. Additionally, downstream signaling pathways, related to the SOD 1 were analyzed. Within the scope of this thesis, predictive biomarker candidates for the response to FOLFOX chemotherapy were discovered, using a panel of cell cultures and newly developed, as well as already established proteomic workflows. These very promising biomarker candidates and their combinations are planned to be validated in the clinical setting using large, heterogeneous groups in order to verify a clinical application in the future.