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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-69797
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2014/6979/


Lokalisation und Quantifizierung der Aufnahme von Nanokristallen in der Leber

Bargheer, Denise

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SWD-Schlagwörter: Nanopartikel , In vivo , Isotopenmarkierung
Freie Schlagwörter (Deutsch): SPIO , Quantum Dot
Basisklassifikation: 35.99
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Nielsen, Peter (PD Dr. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 08.08.2014
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 22.09.2014
Kurzfassung auf Deutsch: In dieser Arbeit wurde mithilfe einer postsynthetischen Radiomarkierung von cadmiumbasierten Quantum Dots (QDs) mit 65Zn und von superparamagnetischen Eisenoxid-Nanokristallen (SPIOs) mit 51Cr die Bioverteilung dieser polymerumhüllten Partikel in Mäusen nach i.v. Injektion untersucht.
Eine postsynthetische Radiomarkierung der äußersten ZnS-Schale von QDs mit 65Zn resultierte in einem labilen Label, das bei der ultraschallgesteuerten Polymerverpackung zum Teil verloren ging. Es konnte dennoch dazu genutzt werden, Grundzüge der Bioverteilung von polymerumhüllten QDs zu untersuchen. Die QDs reicherten sich in kurzer Zeit vorrangig in der Leber an. In einem Zeitraum von vier Wochen kam es zu einer Umverteilung der 65Zn-Aktivität, die auf eine partielle Degradation der QDs zurückzuführen war.
Im Gegensatz zu den 65Zn-markierten QDs, zeigten die mit 51Cr radiomarkierten SPIOs ein stabiles Label. Analog zu den QDs erlaubte dieses die Verfolgung der Kurzzeitverteilung der SPIOs und wies eine Anreicherung in der Leber nach. Anders als die Zinkaktivität retinierte die 51Cr-Aktivität über einen Zeitraum von vier Wochen weitestgehend in der Leber, obwohl die Partikel schon größtenteils degradiert waren, wie bereits frühere Studien gezeigt haben. Diese Ergebnisse sprechen gegen einen spezifischen Export von dreiwertigen Cr-Ionen aus Leberzellen, was nach bisherigen Modellen physiologisch möglich sein müsste. Sie unterstützen daher die These, dass Chrom kein essentielles Spurenelement ist, obwohl dies in der Literatur seit nun mehr 50 Jahren diskutiert wird.
Von bisherigen Studien war bekannt, dass die hier verwendeten polymerverpackten Nanopartikel nach i.v. Injektion im Wesentlichen vom Mononukleären Phagozyten System der Leber, also von Kupffer-Zellen (KC) und sinusoidalen Endothelzellen (LSEC), aufgenommen werden. In verschiedenen Experimenten wurde nun versucht, die Verteilung zu quantifizieren und zusätzlich die Rolle von Hepatozyten an der direkten Nanopartikel-Aufnahme genauer zu untersuchen. Die vorliegende Arbeit beschreibt erstmalig eine Methode, bei der primäre murine Leberzellen, welche SPIOs aus einer i.v. Injektion aufgenommen haben, mithilfe einer Säule in einem Magnetfeld isoliert werden können. Immunzytochemische Färbungen sowie Analysen mittels Durchflusszytometrie zeigten, dass KC und LSEC die Partikel zu fast gleichen Teilen aufnehmen. Ein vergleichbares Bild ergab sich bei mikroskopischen Untersuchungen von murinen Lebergewebsproben nach Injektion von polymerumhüllten QDs. Eine direkte Nanopartikel-Aufnahme in Hepatozyten konnte in vivo nicht beobachtet werden, obwohl diese Zellen aufgrund der Partikelgröße theoretisch direkt erreicht werden könnten. Wurden hingegen primäre Hepatozyten 2 h nach Injektion von 59Fe-markierten SPIOs präpariert, war Aktivität in den Zellen zu finden. Unter Berücksichtigung der übrigen Befunde, wurde dieses Ergebnis als rasche Zulieferung von freigesetztem Eisen aus metabolisierten SPIOs aus anderen Leberzellen gewertet.
In weiteren Versuchen wurde die Möglichkeit untersucht, ob durch Kopplung von Proteinen an die Nanopartikel ein aktives Umlenken der Nanopartikel in Hepatozyten hinein ermöglicht werden kann. Als Ligand wurde Transferrin ausgewählt, dessen hohe Affinität für Hepatozyten in vivo weitläufig bekannt ist. Sowohl in Zellkultur als auch in vivo konnte jedoch keine verstärkte Aufnahme von entsprechenden Nanopartikel-Konstrukten in Hepatozyten gefunden werden. Eine mögliche Erklärung ist, dass das Protein für das spezifische Targeting in vivo durch die rasche Bildung einer Proteinkorona maskiert wird und deshalb nicht mehr von den Zellen erkannt werden kann.
In Studien mit 59Fe-markierten SPIOs und daran gebundenem, 125I-markiertem, murinen Transferrin wurde der Einfluss der Proteinkorona-Bildung auf die Aufnahme in Leberzellen von Mäusen in vivo direkt untersucht. Dabei wurden Nanopartikel-Konstrukte mit kovalent gebundenem 125I-Transferrin mit Konstrukten verglichen, an welche Transferrin nur adsorbiert war. In beiden Fällen fand sich kein Unterschied in der Verteilung der Label und Transferrin wurde wie der Partikel selbst rasch aus dem Plasma entfernt und von der Leber aufgenommen. Dies zeigte, dass die rasche Korona-Bildung in vivo die Transferrin Moleküle zwar nicht von der Partikeloberfläche verdrängt, sehr wohl aber in der Lage zu sein scheint, sie zu maskieren.
Ein Ansatz für ein spezifisches Targeting gelang schließlich mit der Wahl einer anderen Hülle. Wurden Nanopartikel in rekombinante Lipoproteinmizellen eingebettet und die Mäuse vor i.v. Injektion einer Kälteaktivierung unterzogen, konnten höhere Aktivitäten in Hepatozyten verzeichnet werden, welche auf eine direkte Partikelaufnahme zurückgeführt wurden.
Die Arbeit liefert einen wichtigen Beitrag zum Verständnis des Verhaltens von Nanokristallen in einer biologischen Umgebung (in vitro und in vivo).
Kurzfassung auf Englisch: In this study a postsynthetic radiolabelling of superparamagnetic iron oxide nanocrystals (SPIOs) with 51Cr, and of cadmium-based Quantum Dots (QDs) with 65Zn, was used to study the biodistribution of these nanoparticles in mice post i.v. injection.
A postsynthetic radiolabelling of QDs with 65Zn resulted in an unstable label that was partially lost in the sonication-guided polymer-coating. Nevertheless it could be used to investigate basic principles of the biodistribution of the QDs. The QDs showed an accumulation in the liver in the short-term distribution. Moreover a redistribution of the 65Zn-label in a time period of four weeks was attributed to a partial degradation of the QDs.
The radiolabelling of SPIOs with 51Cr gave a stable label, which enabled the short-term biodistribution of SPIOs to be followed. Moreover our results showed that the 51Cr activity is, in most instances, retained in the liver for four weeks, even though the particles were already largely degraded (according to results from 59Fe-SPIOs). These findings argue against a specific export of trivalent chromium ions from liver cells, although this should be possible according to previous models in the literature. It supports the idea that chromium is not an essential trace element, as was first discussed 50 years ago.
From previous studies it was known that the polymer-coated SPIOs used here are predominantly taken up by the mononuclear phagocyte system of the liver post i.v. injection, meaning Kupffer cells (KC) and sinusoidal endothelial cells (LSEC). Various experiments were undertaken, to quantify the distribution and to investigate the role of hepatocytes in direct nanoparticle uptake. A method has been developed in which murine non-parenchymal cells, ingesting SPIOs through i.v. injection, were isolated using a column in a magnetic field. Immunocytochemical staining and flow cytometry-analysis showed that KC and LSEC incorporate the particles in almost equal quantities. A similar pattern was evident in microscopic examinations of murine liver tissue after injection of polymer-coated QDs. No uptake of nanoparticles into hepatocytes could be observed in vivo, although in theory this should be possible in hepatocytes due to the particle size. However, there could be evidence found of activity in hepatocytes isolated 2 h post i.v. injection of 59Fe-SPIOs. But taking into account the remaining findings, this hepatocyte activity was attributed to a rapid degradation of the particles in non-parenchymal cells and the subsequent transport of released iron into hepatocytes.
Furthermore it was investigated whether it is possible to guide nanoparticles into hepatocytes by coupling of proteins to the nanoparticle surface. For this purpose transferrin was selected as high affinity ligands for hepatocytes. However, no increased uptake of those modified nanoparticles into hepatocytes could be found, either in cell culture models or with in vivo experiments. It appeared possible that the protein for the specific targeting is masked by the rapid formation of a protein corona in vivo and cannot be detected anymore by the hepatocytes.
Therefore protein corona formation and its influence on the uptake of modified nanoparticles into the liver of mice was examined by using 125I-labelled murine transferrin coupled to 59Fe-SPIOs. At the same time properties of those constructs were compared to nanoparticle constructs on which transferrin was merely adsorbed during incubation. No difference in the biodistribution of the labels of both constructs was found. Transferrin molecules bound to the particles were rapidly cleared from plasma and taken up by the liver. The experiment showed that the transferrin molecules were not displaced from the particle surface during proteincorona formation, but may be masked by it.
An approach for a targeted delivery was finally achieved by choosing another surface modification. Nanoparticles were embedded in recombinant lipoprotein micelles. A simultaneous cold exposure of 24 h pre i.v. injection resulted in an increased hepatocyte activity, which was probably caused by nanoparticle uptake in hepatocytes.
This work provides an important contribution to our understanding of the behaviour of nanocrystals in a biological environment, both in vitro and in vivo.

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