TDP-43 and Translational Regulation in Amyotrophic Lateral Sclerosis and Related Neurodegenerative Diseases

Abstract

Transactive Response (TAR) DNA-Binding Protein 43 (TDP-43) is a ubiquitously expressed RNA-binding protein that is normally localized in the nucleus, but relocates to the cytoplasm of affected cells under disease conditions. TDP-43 was identified as the major protein component of cytoplasmic aggregates found in amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and frontotemporal lobar degeneration (FTLD). Additionally, several TDP-43 mutations were identified in ALS patients, indicating that TDP-43 may be a major cause of disease. Whether TDP-43 is causing disease due to a nuclear loss of function, a cytoplasmic gain of function, or a combination of the two is not yet known. TDP-43 binds to approximately 30% of the mouse transcriptome, and participates in splice regulation for many of these mRNAs. However, it was revealed that TDP-43 frequently binds cytoplasmically localized mRNAs at their 3’ UTRs. Previous research has identified several RNA-binding proteins that bind to the 3’ UTR’s of cytoplasmic mRNAs as translational regulators. It would be of great interest to the field of neurodegenerative disease research to identify whether TDP-43 plays such a role, and if so, what mRNAs are translationally regulated by TDP-43.

This thesis shows that both knockdown of TDP-43 and transient expression of several TDP-43 variants (human TDP-43, human TDP-43 targeted to the cytoplasm, and human TDP-43 containing a patient mutation) in cell culture do not show any effects on general translation under normal conditions. Additionally, a focused look at a subset of genes with TDP-43 3’ UTR binding sites showed no altered specific translation for these genes. However, since TDP-43 does bind to such a large percentage of mRNAs, it is likely that experimentation on a genome-wide scale would be needed in order to identify mRNAs that are specifically regulated by TDP-43. To this end, multiple genome-wide translation assays – including polysome profiling, BacTRAP analysis, and ribosome footprinting – were established during the time of this work using motor neuron-like cell culture and ChAT-positive neurons in mouse brainstems. These assays are robustly functional, and will provide major insight into what mRNAs TDP-43 translationally regulates.

Intriguingly, the work done in this thesis showed that TDP-43 associates with polysomes and can be immunoprecipitated with ribosomes. This is a very important finding as it is the first time that TDP-43 has been shown to associate with translational machinery without the addition of stress-inducing agents, thus supporting the idea that TDP-43 may be involved in translational regulation. This thesis provides important new data showing TDP-43’s association with polysomes/ribosomes and a strong starting point for continued study of TDP-43’s involvement with translation, particularly with regard to the specific mRNAs that TDP-43 may translationally regulate. Such research is of great interest to the neurodegenerative disease research community, as it could provide possible drug targets.

Das „Transactive Response“ (TAR) DNA-Bindeprotein 43 (TDP-43) ist ein RNA-Bindeprotein welches ubiquitär im Organismus exprimiert wird und im Zellkern lokalisiert ist. Unter Krankheitsbedingungen kann es jedoch vom Nukleus ins Zytoplasma betroffener Nervenzellen relokalisiert werden. Bei Amyotropher Lateralsklerose (ALS) und Frontotemporaler Demenz (FTD) wurde TDP-43 als ein Hauptproteinbestandteil der in den Nervenzellen vorliegenden zytoplasmatischen Aggregate identifiziert. Darüber hinaus wurden in ALS-Patienten verschiedene TDP-43-Mutationen gefunden, weswegen TDP-43 als eine der Hauptursachen dieser Erkrankungen gilt. Ob sie dadurch verursacht werden, dass TDP-43 seine Funktion im Zellkern nicht mehr wahrnehmen kann, oder dadurch, dass es zu einer überhöhten Funktion im Zytoplasma kommt oder durch eine Kombination aus beidem, ist jedoch noch nicht bekannt. TDP-43 bindet an etwa 30% des murinen Transkriptoms, und ist an der Spleißregulation vieler dieser mRNAs beteiligt. Es konnte zusätzlich gezeigt werden, dass TDP-43 häufig an die 3’-UTR zytoplasmatisch lokalisierter mRNAs bindet. Fühere Studien konnten verschiedene RNA-Bindeproteine identifizieren, welche an die 3’-UTR zytoplasmatischer mRNAs binden und somit als Translationsregulatoren fungieren. Entsprechend wäre es für die Forschung im Bereich neurodegenerativer Erkrankungen von großem Interesse zu ermitteln, ob TDP-43 ebenfalls solch eine Rolle bei der Translationsregulation spielt, und welche mRNAs von TDP-43 potentiell reguliert werden.

Die vorliegende Arbeit zeigt, dass sowohl das Herunterregulieren von TDP-43 als auch eine transiente Expression verschiedener TDP-43-Varianten (humanes TDP-43, humanes zytoplasmatisches TDP-43, und humanes TDP-43 mit einer Patientenmutation) in Zellkultur unter normalen Bedingungen keinen Effekt auf die Translation ausüben. Die Untersuchung einer Auswahl von Genen mit TDP-43 3’-UTR-Bindestelle zeigte auch für diese jeweils spezifische Translation keine Veränderung. Da TDP-43 sehr viele mRNAs bindet, muss also systematisch eine genomweite Untersuchung durchgeführt werden, um mRNAs zu identifizieren, welche spezifisch durch TDP-43 reguliert sind. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit mehrere genomweite Translationsstudien unter Verwendung motorneuronartiger Zellen und aus dem murinen Hirnstamm gewonnener ChAT-positiver Zellen etabliert; darunter Polysomanalyse, BacTRAP-Analyse, und Ribosom-Footprinting-Analyse. Mit Hilfe dieser funktional sehr robusten Assays ist es möglich, einen genauen Einblick über die von TDP-43 potentiell regulierten mRNAs zu gewinnen.

Bemerkenswerterweise konnte hier gezeigt werden, dass TDP-43 sowohl mit Polysomen assoziiert als auch mit Ribosomen immunpräzipitiert werden kann. Dies ist der erste Beleg dafür, dass TDP-43 auch ohne zusätzliche Stressinduktion mit dem Translationsapparat assoziiert, wodurch die Vermutung, dass TDP-43 bei der Translationskontrolle eine Rolle spielt, stark unterstützt wird. Die in dieser Arbeit gefundene Assoziation von TDP-43 mit Polysomen/Ribosomen liefert einen wichtigen Ausgangspunkt für weitere Untersuchungen hinsichtlich der Rolle von TDP-43 bei der Translation, insbesondere im Hinblick auf spezifische mRNAs, welche von TDP-43 reguliert werden könnten. Solche Untersuchungen sind vor allem für die Erforschung neurodegenerativer Erkrankungen von großer Bedeutung, da sie Hinweise für potentielle Therapieansätze und Wirkstoffziele liefern könnten.