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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-69984
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2014/6998/


Der Virulenzfaktor P46 und seine Bedeutung für Wirtsspezifität und Infektiosität des Parasiten Leishmania major [Bray et al., 1973]

Bifeld, Eugenia

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Leishmania , Virulenzfaktor
Freie Schlagwörter (Englisch): Leishmania , virulence factor
Basisklassifikation: 42.13 , 42.36
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Clos, Joachim (PD Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 04.07.2014
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 07.10.2014
Kurzfassung auf Deutsch: Leishmanien sind einzellige Parasiten der Familie Trypanosomatidae und Verursacher eines Spektrums von Erkrankungen, die zusammenfassend als Leishmaniosen bezeichnet werden. In ihrem biphasischen Lebenszyklus zirkulieren sie zwischen Sandmücken, in denen sie als begeißelte, extrazelluläre Promastigoten existieren, und den Vertebraten (vorwiegend Säuger), in denen sie als nicht-motile Amastigoten in phagozytierenden Zellen leben.
Um sich an diese gegensätzlichen Lebensräume anzupassen und die eigene Transmission zu sichern, werden stadienspezifisch Moleküle synthetisiert, mit denen die physiologischen Funktionen und die Abwehrsysteme des jeweiligen Wirtes zugunsten der eigenen Persistenz moduliert werden. Diese Moleküle werden als Virulenzfaktoren bezeichnet. Einer dieser Faktoren ist P46 (Reiling et al., 2010).
Die funktionellen Domänen und die Eigenschaften dieses Virulenzfaktors sollten in dieser Arbeit charakterisiert werden. Dafür wurden vier Ansätze verfolgt: (i) Mutagenese, (ii) Transfektion von Makrophagen, (iii) Sequenz-und Selektionsanalysen, (iv) Erzeugung von P46-Genaustauschmutanten.
Durch Mutagenese konnten sowohl P46-Deletionsmutanten als auch P46-Fusionsproteine synthetisierende Parasiten hergestellt werden. Die funktionelle Region des Proteins konnte durch die Expression veränderter P46-Gene im N-Terminus lokalisiert werden. Auch die Lokalisation des Proteins konnte in infizierten, lebenden ex vivo Makrophagen durch die Expression Fluorochrom-markierter P46-Varianten bestimmt werden. Die Transfektion von Makrophagen mit P46-Expressionskonstrukten war nicht erfolgreich.
Sequenzanalysen von P46 aus unterschiedlichen L. major-Isolaten ergaben eine P46-Phylogenie, die mit der geographischen Verteilung der Parasiten korrelierte. Eine solche Korrelation konnte weder bei der Phylogenie von L.mj Hsp23 noch von L.mj HIP festgestellt werden, was gegen eine zufällige Gendrift als Ursache für die Sequenzunterschiede spricht. Diese These wurde durch einen vom Wirt abhängigen Selektionsdruck auf eine bestimmte P46-Sequenz in vivo untermauert.
Schließlich konnten P46-Genaustauschmutanten erzeugt und für Infektionsstudien eingesetzt werden. Sie zeigten eine im Vergleich mit Wildtyp-Zellen verringerte Virulenz in vitro und in vivo. Komplementation des P46-Genverlusts durch episomale P46-Genkopien führte zu Wildtyp-ähnlicher Virulenz in vitro, jedoch nicht in vivo, was auf einen möglicherweise adversen Effekt von P46 Überexpression hindeutet.
Zusammenfassend zeigen meine Ergebnisse, dass P46 nicht bestimmend, jedoch notwendig für eine vollständige Ausprägung der Infektiosität des Parasiten ist.
Kurzfassung auf Englisch: Leishmania spp. are sandfly-transmitted parasitic protozoa that are etiologic for a spectrum of diseases, summarily termed Leishmaniases. In the insect gut these parasites exist as elongated promastigotes, which are flagellated and motile. These promastigotes are transmitted to the mammalian host during a sandfly blood meal. Once inoculated, the parasites are rapidly taken up by professional phagocytes such as neutrophils and most notably macrophages. Within acidified vacuoles, Leishmania spp. replicate as spherical, non-motile amastigotes for the duration of the host cell‘s life span.
To adapt to the two dramatically different hosts and to maintain their life cycle through transmission, Leishmania spp. produce a variety of molecules. These molecules include virulence factors which are produced both stage- and species-specifically. P46 was found to be one such virulence factor (Reiling et al., 2010).
In this thesis, P46 was subjected to characterisation to gain insight into its mode of function. To this end, four approaches were chosen: (i) deletion mutagenesis and fusion protein expression, (ii) expression in murine macrophages, (iii) molecular epidemiology and (iv) reverse genetics of P46.
P46::mCherry chimeras revealed the localisation of the protein in the cytosol of infected ex vivo macrophages via live imaging microscopy. The protein region responsible for infectivity enhancement was traced to the N-terminus both by the expression of truncated P46 genes and by mCherry tagged P46 gene expression in L. major followed by ex vivo infection studies. It was not possible to transfect murine macrophages with P46 expression plasmids.
Molecular epidemiology of P46 showed a geographical distribution of P46 sequence variants. Similar correlations between the geographical origin and protein sequences could not be observed for other L. major genes such as L.mj Hsp23 or L.mj HIP. Therefore, the P46 sequence variations between geographic distinct L. major isolates are not based on an overall genetic drift but rather seem to correlate with the predominant reservoir animals in endemic regions. Passaging parasites that expressed three distinct P46 sequence variants in vivo revealed a host dependent selection for a particular P46 variant, supporting the notion that P46 is involved in host adaptation.
Finally P46 could be confirmed as a virulence factor based on an attenuated phenotype in vitro and in vivo after replacement of the P46 gene in L. major. Wild type virulence in ex vivo infections could be restored by adding a P46 gene copy to the P46-/- mutants (L.mj P46-/-/+). However, this did not restore virulence in vivo, indicating an adverse effect of the ∼40-fold P46 overexpression during mouse passage. In summary P46 seems to be expendable for basal infectivity of the parasite but necessary for a fully developed virulence.

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