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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-70148
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2014/7014/


Untersuchungen zur Synthese, PEGylierung und Funktionalisierung von Goldnanopartikeln für medizinische Anwendungen

Schulz, Florian

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SWD-Schlagwörter: Nanopartikel , Oberflächenchemie , Gold , Synthese
Freie Schlagwörter (Englisch): Polyethylenglycol , Funktionalisierung , Nanomedizin
Basisklassifikation: 35.18
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Weller, Horst (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 30.04.2014
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 21.10.2014
Kurzfassung auf Deutsch: In dieser Arbeit wurde die Synthese und Funktionalisierung von Goldnanopartikeln, AuNP, in wässrigen Lösungen untersucht. Diese Partikel zeichnen sich durch ihre besonderen physikalischen und chemischen Eigenschaften aus und haben ein enorm breites Anwendungspotential z.B. in der Katalyse, Elektronik, Sensorik, Biotechnologie und Medizin.

Im ersten Teil der Arbeit wurden Studien zur Synthese von citratstabilisierten AuNP nach der von Turkevich et al. etablierten Methode und mit der Seeded Growth Methode vorgestellt. In einer Variation der Turkevich-Synthese wurde durch Verwendung eines Citratpuffers anstelle einer Citratlösung der pH-Wert als entscheidender Parameter der Reaktion kontrolliert und durch einfache Änderungen der Reaktionsführung eine schnellere Durchmischung der Reagenzien erreicht. Mit der optimierten Synthese wurden citratstabilisierte AuNP mit engerer Größenverteilung, und besserer Reproduzierbarkeit der Größe bei gleichzeitig größeren Ansätzen erhalten. Die Variation der Partikeldurchmesser in mehreren Synthesen lag mit der optimierten Methode unter 1.5 % im Vergleich zu etwa 20 % mit der herkömmlichen Methode, die Polydispersitäten lagen bei 8 % im Vergleich zu 10-15 % und die Ansatzgröße betrug 1000 ml im Vergleich zu 150 ml.
Durch die Untersuchungen zur Seeded Growth Synthese konnten Empfehlungen entwickelt werden, mit denen AuNP mit Durchmessern von 12-80 nm besser reproduzierbar und mit besser einstellbarer Größe, sowie mit höherer Stabilität synthetisiert werden können als in publizierten Protokollen und wie unerwünschte Sekundärnukleation und unvollständiger Precursorumsatz vermieden werden können.

Im zweiten Kapitel wurde die Funktionalisierung von AuNP mit Polyethylenglykol- (PEG-) Liganden untersucht, die von herausragender Bedeutung in der Nanomedizin und Biotechnologie sind. Es wurden AuNP, verschiedene PEG-Liganden und die Konjugate synthetisiert und charakterisiert. Es wurde die Stabilisierung der AuNP gegen oxidatives Ätzen mit Cyanid untersucht, aber auch die gegen Elektrolyt-induzierte Aggregation und kompetitiven Austausch mit Dithiothreitol. Durch diese Stabilitätstest konnten Zusammenhänge von Ligandenstruktur und Stabilisierung herausgearbeitet werden. Es wurde der Einfluss von Ligandenlänge und -Zähnigkeit untersucht, ein besonderer Schwerpunkt lag aber auf der verbindenden Struktur zwischen Kopfgruppe und PEG-Rest, dem Spacer. Es konnte der enorme Einfluss des Spacers auf die Stabilität der AuNP-Konjugate gezeigt werden, der deutlich wichtiger scheint als der von PEG-Länge und Zähnigkeit der Kopfgruppe. Als entscheidendes strukturelles Merkmal wurde die Länge des Spacers gefunden. Ein monodentater PEG-Ligand mit einem C10-Alkylspacer, PEGMUA, stabilisierte AuNP über 20 h gegen oxidatives Ätzen mit 100 mM Cyanid, während PEG-Liganden mit kürzeren Spacern unter gleichen Bedingungen nur wenige Minuten stabilisierten.
Weiterhin wurde in diesem Kapitel der Mechanismus der Ätzreaktion von AuNP@PEGMUA-Konjugaten untersucht und der Einfluss von ungebundenen Liganden nachgewiesen. Auf dieser Basis wurde ein vereinfachendes Modell der Ätzreaktion entwickelt, dass die Konkurrenz von Liganden- und Ätzreaktion berücksichtigt. Mit diesem Modell können verschiedene experimentelle Beobachtungen erklärt werden. Ein besseres Verständnis der Ätzreaktion kann helfen, ihren analytischen Wert zu steigern, aber auch, sie für synthetische Anwendungen weiterzuentwickeln.

Im letzten Kapitel wurde gezeigt, dass neurologisch wirksame L1-Peptide in Kombination mit PEGMUA an AuNP gebunden werden können, um ihre Wasserlöslichkeit zu verbessern und Homoaggregation zu unterdrücken. Mittels zeitaufgelöster UV/vis-Spektroskopie wurden die Agglomerationskinetiken der AuNP@L1-Konjugate untersucht. Über das Agglomerationsverhalten konnte die erfolgreiche Bindung von L1-Peptiden, Kontrolle ihres Anteils (L1-Peptid:PEGMUA) in der gemischten Ligandenhülle und die Stabilisierung durch Koadsorption von PEGMUA belegt werden. Die Stabilität der Konjugate mit ausreichendem PEGMUA-Überschuss in relevanten biologischen Puffern wurde über DLS-Messungen und UV/vis-Spektroskopie nachgewiesen. Es wurden Konjugate mit verschiedenen AuNP-Größen, Zusammensetzungen der Ligandenhüllen und Orientierungen der gebundenen L1-Peptide synthetisiert, die dann von Kooperationspartnern am Zentrum für Molekulare Neurobiologie an verschiedenen primären murinen Neuronen und Schwann-Zellen hinsichtlich ihrer biologischen Wirksamkeit getestet wurden. Alle AuNP@L1-Konjugate zeigten auf allen Zelltypen eine signifikant höhere biologische Aktivität als Kontrollen und reine AuNP@-PEGMUA-Konjugate ohne L1-Peptid. In dieser Studie wurde zum ersten Mal demonstriert, dass funktionalisierte AuNP sowohl auf Neuronen als auch auf Schwann-Zellen wirken und Wachstum und Überleben beider Zelltypen stimulieren können. Die AuNP@L1-Konjugate sind vielversprechende Kandidaten für die Therapie von Wirbelsäulenverletzungen und in laufenden und zukünftigen Studien soll deren Aktivität in vivo untersucht und gegebenenfalls optimiert werden.
Kurzfassung auf Englisch: The focus of this work was the synthesis and functionalization of gold nanoparticles, AuNP, in aqueous media. These particles feature unique physical and chemical properties and have high potential in a broad range of applications, e.g. in catalysis, electronics, sensing, biotechnology and medicine.

In the first chapter of the thesis, investigations of the well-established Turkevich-synthesis of citrate-stabilized AuNP and of the seeded growth method were presented. The Turkevich-synthesis was improved by using a citrate-buffer instead of a citrate-solution, to control the pH of the solution as a key parameter and by straightforward adjustments of the original protocol to improve the mixing of the reagents. The optimized synthesis yielded larger volumes of citrate-stabilized AuNP with improved monodispersity and better reproducibility of the AuNP-diameter. The variation of the AuNP-diameter was below 1.5 % with the optimized protocol, compared to about 20 % with the original one, the polydispersities were around 8 %, compared to 10-15 % and 1000 ml of AuNP were obtained, compared to 150 ml.
By studying the seeded growth method, strategies were developed, which allow to synthesize AuNP with diameters from 12-80 nm with improved reproducibility and better control of particle size as well as higher stability compared to published protocols. These strategies also help to avoid secondary nucleation and incomplete reaction of precursor.

In the second chapter the functionalization of AuNP with poly(ethylene glycol)- (PEG-) based ligands was investigated. AuNP, PEG-ligands und AuNP-conjugates were synthesized and characterized. Mainly, the stabilization of AuNP against oxidative etching with cyanide was tested, but also that against electrolyte-induced aggregation and competitive displacement with dithiothreitol. With such stability tests, relationships of ligand structure and stabilization could be deduced. The influence of ligand-length and -denticity was also tested, but the main focus was on the structure connecting the headgroup with the PEG-moiety, the spacer. The enormous impact of the spacer on AuNP-conjugate stability was shown, which seems to be much more important than that of PEG-length and headgroup denticity. As a key structural feature, the length of the spacer was identified. A monodentate PEG-ligand with a C10-alkyl spacer, PEGMUA, stabilized AuNP for 20 h against oxidative etching with 100 mM cyanide, while PEG-ligands with shorter spacers stabilized just a few minutes under the same conditions.
Additionally, the mechanism of AuNP-conjugate etching was investigated in this chapter and the influence of unbound ligands was shown. Based on these experiments a simplifying model of the etching reaction was developed, that takes into account the competition of ligand and etching reaction. With this model several experimental findings can be explained. A better understanding of the etching reaction can help to improve its value as an analytical tool and also to further develop it for synthetic applications.

In the third chapter it was shown that neurologically active L1-peptides can be bound to AuNP in combination with PEGMUA to improve their solubility in water and suppress homoaggregation. The kinetics of AuNP@L1-conjugate agglomeration were analyzed by time-resolved UV/vis spectroscopy. By analyzing the agglomeration processes, the binding of L1-peptides, control of their ratio (L1-peptide:PEGMUA) in the mixed ligand layers and the stabilization by coadsorption of PEGMUA was proved. The stability of conjugates with sufficient excess of PEGMUA in the ligand layer in relevant biological buffers was confirmed by DLS- and UV/vis-analyses. Conjugates with different AuNP-diameters, compositions of the ligand layers and orientations of the L1-peptides were synthesized and then tested with different types of primary neurons and Schwann-cells for biological activity by project partners at the Center for Molecular Neurobiology, Hamburg. All AuNP@L1-conjugates showed significantly higher activity on all types of cells than controls and AuNP@PEGMUA-conjugates with no L1-peptides. This study demonstrated for the first time that functionalized AuNP can act on both neurons and Schwann-cells and stimulate growth and survival of these cell types. These AuNP@L1-conjugates are promising candidates for the therapy of spinal cord injuries and ongoing and future studies will test and, if necessary, optimize their in vivo activity.

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