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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-70396
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2014/7039/


Bedeutung der Expression von RAD51 für die Reparatur von DNA-Schäden mittels Homologer Rekombination in humanen Tumorzelllinien

Seelbach, Jasna Irena

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SWD-Schlagwörter: DNS-Reparatur , Homologe Rekombination , Onkologie
Freie Schlagwörter (Deutsch): RAD51-Expression , Tumorzellen
Basisklassifikation: 30.30 , 42.13 , 42.15 , 35.70 , 44.81
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Dikomey, Ekkehard (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 24.10.2014
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 11.11.2014
Kurzfassung auf Deutsch: Das Ziel dieser Arbeit war es zu klären, warum eine erhöhte RAD51-Expression, welches das Schlüsselprotein der Homologen Rekombination (HR) ist, in vielen Tumorentitäten zu einer negativen Prognose für das Überleben der Tumorpatienten führt. Für Brust (BrCa)- und Kopf-Hals (HNSCC)-Tumore sollte daher anhand von jeweils zehn Zelllinien untersucht werden, wie sich Unterschiede in der RAD51-Expression auf die Kapazität und Funktionalität der DSB-Reparatur mittels HR auswirken.
Es konnte gezeigt werden, dass für beide Tumorentitäten die Zelllinien jeweils ein sehr breites Spektrum in der RAD51-Expression aufwiesen, mit einer sehr niedrigen bis sehr hohen Expression. Die unterschiedliche Menge hatte in beiden Entitäten einen erheblichen Einfluss auf die Kapazität der HR. Zum Nachweis wurde dabei ein Reparaturplasmid verwendet, bei dem die intakte Reparatur von Doppelstrangbrüchen (DSBs) mit zwei offenen Enden (zwei-endig) mittels HR bestimmt wurde. Bei einer geringen RAD51-Expression war die HR-Kapazität jeweils nur sehr gering, bei einer moderaten RAD51-Expression dagegen immer am höchsten und bei einer hohen RAD51-Expression wiederum sehr gering. Für die BrCa-Zelllinien wurde ein Verhältnis von 0,4:1,0:0,3 und HNSCC-Zelllinien ein Verhältnis von 0,3:1,0:0,2 gefunden. Somit ermöglicht nur eine moderate RAD51-Expression eine maximale HR-Kapazität.
Die geringe HR-Kapazität in Zelllinien mit hoher RAD51-Expression ließ sich weder auf einen verminderten Kerntransport noch auf eine reduzierte Ausbildung von RAD51-Reparaturaggregaten zurückführen. Eine verminderte Akkumulation von Zellen in der S-Phase, welches eine Voraussetzung für die HR ist, konnte ebenfalls ausgeschlossen werden.
Die bei hoher RAD51-Expression beobachtete geringe HR-Kapazität bewirkte in fünf von sieben Zelllinien eine sehr hohe zelluläre Empfindlichkeit gegenüber Mitomycin C (MMC). Zwei der Zelllinien zeigten jedoch trotz einer verminderten HR-Kapazität eine Resistenz gegenüber MMC. MMC führt dabei über eine Störung der Replikation zu DSBs mit nur einem offenen Ende (ein-endig). Diese Resistenz war abhängig von RAD51, da eine RAD51 Inhibition zu einer starken Sensitivierung der Zellen gegenüber MMC führte. In weiteren Versuchen konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung der Intra-S-Phase Signalkaskade hierfür entscheidend war. Bei Zelllinien, die eine hohe RAD51-Expression aufwiesen, bewirkte damit eine erhöhte CHK1 (Checkpoint Kinase 1)-Expression mit einer intakten Aktivierung eine Resistenz gegenüber MMC.
Zusammenfassend kann in dieser Arbeit erstmalig gezeigt werden, dass eine erhöhte RAD51-Expression immer zu einer verminderten Reparatur von zwei-endigen DSBs mittels HR führte. Die Reparatur von ein-endigen DSBs an der Replikationsgabel mittels HR wird aber neben der RAD51-Expression auch durch die Stärke der übergeordneten CHK1-vermittelten Signalkaskade bestimmt.
Die negative Prognose für Tumorpatienten mit erhöhter RAD51-Expression kann somit in der Regel auf eine verminderte HR-Kapazität und damit erhöhte genomische Instabilität der Zellen zurückgeführt werden. Bei gleichzeitig erhöhter CHK1-Expression mit entsprechend ausgeprägter Signalkaskade könnte aber auch eine Zunahme in der Therapieresistenz die Ursache für die schlechte Prognose sein. Deshalb sollte in zukünftigen klinischen Studien sowohl die RAD51-Expression als auch die CHK1-Expression als Biomarker für eine Prognose überprüft werden.
Kurzfassung auf Englisch: The aim of this study was to elucidate why a highly elevated expression of RAD51, key player of homologous recombination (HR), was identified as a negative prognostic marker for the survival of tumor patients in several kinds of tumor. For investigations ten breast cancer (BrCa) and ten head an neck squamous cell carcinoma (HNSCC) cell lines were chosen, in which the effect of different levels of RAD51-expression on capacity and functionality of double-strand break (dsb) repair via HR was analyzed.
This study revealed a broad spectra of RAD51-expression in each tumor entity, ranging from a very low to a very high RAD51-expression. Differences in RAD51-expression highly influenced the capacity of HR. For investigations of the HR-capacity a repair plasmid containing a dsb with two open ends (two-ended) was used. A low RAD51-expression revealed a low HR-capacity, a moderate RAD51-expression the highest HR-capacity and a high RAD51-expression a low HR-capacity again. BrCa cell lines displayed a ratio of 0,4:1,0:0,3 und HNSCC cell lines a ratio of 0,3:1,0:0,2. Therefore, only a moderate RAD51-expression allowed a maximal HR-capacity.
The low HR-capacity in cell lines with a high RAD51-expression was neither due to a diminished transport to the nucleus nor a reduced formation of RAD51-foci. A reduced accumulation of cells in the S-phase in cell lines with a high RAD51-expression, which is a requirement for HR, was also excluded. A high RAD51-expression with a low HR-capacity revealed a high cellular sensitivity to treatment with Mitomycin C (MMC) in five out of seven cell lines. Although two cell lines expressed a great resistance against MMC, despite their low
HR-capacity. MMC causes dsbs with only one open end (one-ended) by interfering with replication. This resistance was due to RAD51, because inhibition of RAD51 sensitized those cells to MMC-treatment. Further experiments showed that activation of the intra-s-phase cascade was crucial for the mentioned cellular sensitivity. In cell lines with a high RAD51-expression an elevated CHK1-expression in addition to a its proper activation contributed to the observed resistance.
Taken together, this study shows for the first time that a high RAD51-expression always caused a diminished repair of two-ended dsbs via HR. In contrast, for repair of one-ended dsbs at replication forks via HR the level of upstream CHK1-faciliated signaling was crucial in addition to a high RAD51-expression.
In conclusion, the negative prognosis for tumor patients with a high RAD51-expression ordinarily can be attributed to a diminished HR-capacity and an elevated genomic instability of tumor cells. A simultaneously elevated CHK1-expression in addition to a functional signaling can also cause a higher resistance to tumor therapie. Therefore, in future clinical trials the RAD51-expression as well as the CHK1-expression should be included as biomarkers for prognosis.

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