Die Metabolisierung der Dimethylarginine durch die Enzyme AGXT2 und DDAH1 und deren Anwendung für den Prozess der Drug Discovery

Abstract

Asymmetrisches Dimethylarginin (ADMA) ist ein kompetitiver Hemmer der NO-Synthase (NOS) und wird vorwiegend durch das Enzym Dimethylarginin-Dimethylaminohydrolase (DDAH) zu L-Citrullin abgebaut. ADMA und DDAH sind in unterschiedlichen Krankheitsbildern involviert, die mit einem veränderten NO-Stoffwechsel einhergehen. So konnten Assoziationen zwischen erhöhten ADMA-Plasmakonzentrationen, die durch eine erniedrigte DDAH-Aktivität oder -Expression verursacht werden, mit dem metabolischen Syndrom, endothelialer Dysfunktion und einer Vielzahl kardiovaskulärer Erkrankungen in Verbindung gebracht werden. Idiopathische Pulmonale Fibrose (IPF), Alzheimer und manche Tumorerkrankungen sind hingegen mit einer Überproduktion von NO, niedrigen ADMA-Konzentrationen und einer erhöhten Expression der DDAH assoziiert. Die Manipulation des NO-Stoffwechsels über DDAH-Inhibitoren oder -Aktivatoren stellt eine neue und vielversprechende therapeutische Option zur Beeinflussung dieser Erkrankungen dar. Ziel der Arbeit war die Identifizierung potenzieller Modulatoren, da die bisher bekannten Inhibitoren keine ausreichende Selektivität gegenüber anderen Enzymen zeigten oder Studien über deren in-vivo-Verhalten fehlen. Des Weiteren wurden bisher keine aktivierenden Substanzen der DDAH gefunden. In dieser Arbeit wurde ein High-Throughput Screening (HTS) von 52.096 Compounds mit Hilfe eines optimierten Fluoreszenz-basierten DDAH-Aktivitätsassays durchgeführt. Nach der Hit-Validierung wurden 18 potente Strukturen mit einem hemmenden Effekt identifiziert. Einige Moleküle weisen eine neuartige Struktur auf oder stellen Analoga von bereits bekannten DDAH-Inhibitoren dar. In dieser Arbeit konnten erste Hinweise über eine mögliche Verbindung zwischen der humanen DDAH1 und Thioharnstoff-ähnlichen Substanzen in-vitro gezeigt werden. Potenzielle DDAH-Aktivatoren konnten hingegen nicht identifiziert werden. Symmetrisches Dimethylarginin (SDMA) stellt im Gegensatz zu ADMA kein direkter Inhibitor der NOS dar, beeinträchtigt jedoch die intrazelluläre Bereitstellung von L-Arginin zur NO-Produktion durch Hemmung des kationischen Aminosäure-Transporters. Neben der Assoziation erhöhter SDMA-Plasmakonzentrationen mit der Gesamtmortalität nach ischämischem Schlaganfall ist über weitere Effekte wenig bekannt. Seit kurzer Zeit ist die Metabolisierung von SDMA durch das Enzym Alanin-Glyoxylat-Aminotransferase 2 (AGXT2) im Gespräch, da unter anderem in Genom-weiten Assoziationsstudien (GWAS) deren genetischer Zusammenhang gezeigt werden konnte. Erhöhte SDMA-Konzentrationen waren dabei mit einer Punktmutation (rs37369) im codierenden Bereich assoziiert. Ziel dieser Arbeit war die Bestätigung der Hypothese über den Abbau von SDMA durch AGXT2 und die eingeschränkte Aktivität der AGXT2-Mutante auf Proteinebene. Da wenig über die Funktion dieser Isoform bekannt ist, sollte außerdem das Organ-spezifische Expressionsmuster des Enzyms untersucht werden. In der Arbeit wurde ein AGXT2-Aktivitätsassay optimiert und der enzymatische Abbau von SDMA konnte bestätigt werden. Die Variante rs37369 wies eine um 50% verminderte enzymatische Aktivität auf. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass die reduzierte Aktivität auch gegenüber des Hauptsubstrates L-Alanin bestehen bleibt. Außerdem konnte zum ersten Mal nachgewiesen werden, dass AGXT2 innerhalb der Niere ausschließlich in den proximalen Tubuluszellen exprimiert wird, das auf einen möglichen Einfluss des Enzyms auf den Energiehaushalt der Zelle hinweist. Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit weitere hemmende DDAH-Strukturen identifiziert werden, mit deren Hilfe die Möglichkeit besteht potentere und weniger toxische Leitstrukturen zu entwickeln und tiefere Einblicke über die Struktur-Wirkungsbeziehungen zu erhalten. Durch den Nachweis der Lokalisation der AGXT2 in der Niere konnte ein weiterer Anhaltspunkt über mögliche Funktionen des Enzyms hervorgebracht werden. Da SDMA als Substrat der AGXT2 bestätigt werden konnte, kann das Enzym als neues therapeutisches Target betrachtet werden. Die hier optimierte Aktivitätsmessung kann dabei als Grundlage für die Entwicklung eines HTS-Assays dienen.

Asymmetrical dimethylarginine (ADMA) is a competitive inhibitor of NO synthase (NOS) and is mainly metabolized to L-citrulline by the enzyme dimethylarginine-dimethylaminohydrolase (DDAH). ADMA and DDAH are involved in different diseases which are associated with an altered NO pathway. Elevated ADMA plasma levels due to downregulation of expression and/or activity of DDAH are linked with the metabolic syndrome, endothelial dysfunction, and numerous cardiovascular diseases. By contrast, Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), Alzheimer’s disease, and some types of cancer are connected with an overproduction of NO, reduced ADMA concentrations and an increased expression of DDAH. The manipulation of the NO pathway through inhibition or activation of DDAH represents a new and promising therapeutic option to therapeutically influence these diseases. One goal of this study was to identify potential modulators given that previous inhibitors lacked selectivity over other enzymes or necessary in-vivo studies are missing. In addition no DDAH-activating compound has been found yet. A high-throughput screening (HTS) with 52.096 compounds was performed with a fluorescence-based DDAH activity assay. After subsequent hit validation 18 potent structures with an inhibiting effect were identified. Several molecules show a novel structure or represent analogues of already known DDAH inhibitors. By finding derivatives of thiamazole it was first shown that the enzyme is propably involved in off-target effects of thyreostatic drugs. In contrast no DDAH-activating compound has been found here, too. Compared to ADMA, symmetrical dimethylarginine (SDMA) is not a direct inhibitor of NOS but impairs the intracellular provision of L-arginine for NO production by inhibiting the cationic amino acid transporter. Next to the association of elevated SDMA levels with overall mortality after ischemic stroke, less is known about other effects. So far it was thought that SDMA is exclusively excreted unchainged by the kidney. Therefore SDMA is known as a renal marker. Lately there are discussions about an enzymatic degradation of SDMA by alanine-glyoxylate-aminotransferase 2 (AGXT2) because of their genetic associations discovered by genome-wide association studies (GWAS). Thereby elevated SDMA concentrations were associated with the single nucleotide polymorphism (SNP) rs37369 in the coding region. One goal of the AGXT2 part was the confirmation of the metabolism of SDMA by AGXT2 and the supposed impaired activity of the mutant form on protein level. Since less is known about the function of this isoform the organ-specific expression pattern for the enzyme had to be investigated. In this study an AGXT2 activity assay was optimized and the enzymatic degradation of SDMA could be confirmed. The variant showed an impaired activity up to 50%. For the first time it was shown that the reduced enzyme activity persisted with the main substrate L-alanine. Furthermore it was firstly proved that the expression of AGXT2 in the kidney is exclusively restricted to the proximal tubule cells. A connection of AGXT2 with energy balance of the cell can be assumed. In summary, in this thesis further DDAH-inhibiting compounds could be identified. With their help there is a chance to develop more potent and less toxic lead structures and to get deeper insights to the relations between the molecular structure and its effects on enzyme activity. By proving the localization of AGXT2 new evidence about its possible function could be generated. Given that SDMA could be confirmed as a substrate of AGXT2 the enzyme can be considered as a new therapeutic target. The optimized activity assay can be used as a base for the development of an HTS-suitable assay.