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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-70833
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2014/7083/


Entfernung proviraler HIV-1 DNA aus infizierten Zellen mittels nicht-integrierender Vektoren

Beschorner, Niklas

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SWD-Schlagwörter: HIV , Gentherapie
Freie Schlagwörter (Deutsch): Lentivirale Vektoren , adenovirale Vektoren , Genome Engineering
Basisklassifikation: 42.03 , 42.32
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Meier, Chris (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 21.11.2014
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 15.12.2014
Kurzfassung auf Deutsch: Die Stabile Integration des HI-Virus in die Chromosomen der Wirtszelle stellt im retroviralen Lebenszyklus einen essenziellen Schritt dar. Alle bisherigen antiviralen Behandlungsstrategien richten sich gegen virale Enzyme oder die Verhinderung des Eintritts in die Zelle. Hierdurch ist es jedoch nicht möglich, HIV zu eradizieren. Es konnte gezeigt werden, dass mittels HIV-1 LTR-spezifischer Rekombinase (Tre-Rekombinase) die provirale DNA effizient aus dem Genom infizierter Zellen entfernt werden kann. Die Tre-Rekombinase ist somit ein neuartiger und vielversprechender Ansatz für die Eradizierung des HI-Virus. Derzeitige gentherapeutische Therapien verwenden lentivirale Vektorsysteme, die stabil in die Chromosomen der Wirtszellen integrieren. Sie weisen damit ein potentielles Risiko für Insertionsmutagenesen auf. Eine stabile Transgenexpression bei gleichzeitiger Verringerung dieses Risikos stellt eine große Herausforderung an die klinische Forschung dar. In dieser Arbeit wurden zwei nicht-integrierende Vektorsysteme etabliert, ein Intergrations-defizienter lentiviraler Vektor und ein chimärer adenoviraler Vektor. Beide Vektorsysteme zeigten eine effiziente und transiente Transgenexpression in vitro. Der nicht-integrierende Vesicular Stomatitis Virus Glykoprotein (VSV-G) pseudotypisierte lentivirale selbstinaktivierende (SIN)-Vektor wurde durch eine Mutation (Klasse 1) der katalytischen Triade der viralen Integrase generiert, wodurch die Integration ins Wirtszellgenom verhindert wurde. Dies führte zu einem Anstieg an episomalen Vektorsequenzen in den transduzierten Zellen. Der chimäre adenovirale Vektor ist vom Adenovirus 5 abgeleitet, wobei die Fiber durch die von Adenovirus 11 substituiert wurde. Dies erhöhte die Infektiosität humaner Zellen, speziell von T-Lymphozyten, da nun als Rezeptor das CD46 Molekül anstelle vom Coxsackie und Adenovirus Rezeptor (CAR) verwendet wurde. Beide Vektorsysteme zeigten eine hohe Transgenexpression unter der Kontrolle eines HIV-Tat abhängigen Promotors.
Beide Vektorsysteme zeigten keinen Einfluss auf die Zellviabilität, auf die Verteilung der Zellzyklusphasen, sowie auf das Apotosemuster von transduzierten Jurkat T-Zellen. Die Funktionalität vektorvermittelter Tre-Rekombinase wurde einerseits mittels Reporterkonstrukten, sowie in HIV-1 Indikatorzellen eindrucksvoll gezeigt. Aufgrund des geringen funktionellen Titers des lentiviralen Vektorsystems wurde für den antiviralen Aktivitätsnachweis in primären HIV-infizierten T-Lymphozyten, nur das adenovirale Vektorsystem verwendet. Das adenovirale Vektorsystem zeigte auch hier signifikante antivirale Effekte. Das chimäre adenovirale Vektorsystem erwies sich somit für die transiente Expression der Tre-Rekombinase als ein effizientes und sicheres Vektorsystem. Somit können die hier erzielten Ergebnisse die weitere Entwicklung einer HIV-Gentherapie mittels autologer T-Zell Transplantation unterstützen, um eine funktionelle Heilung zu erzielen.
Kurzfassung auf Englisch: In the retroviral life cycle the stable integration of HIV into the host-cell chromosomes is an essential step. All current antiretroviral approaches target the viral enzymes or virus entry, but cannot eradicate HIV. Previously it has been shown that an engineered HIV-1 LTR-specific recombinase (Tre-recombinase) can efficiently excise proviral DNA from infected cells and therefore may provide a novel and promising approach to eradicate the virus. Current gene therapy approaches use lentiviral vector systems, which integrate stable into the host cell chromosomes and therefore bear the risk of causing insertional mutagenesis. Therefore, stable transgene expression, while minimizing insertional mutagenesis, is a key challenge in clinical gene therapies. In this thesis two non-integrating vector systems have been developed: a lentiviral vector and a chimeric adenoviral vector. Both showed efficient and transient transgene expression in vitro. The non-integrating vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) pseudotyped lentiviral selfinactivating (SIN)-Vector was produced by a class 1 mutation in the catalytic centre of the integrase, which prevented proviral integration. This resulted in the generation of increased levels of circular vector episomes in transduced cells. The chimeric adenoviral vector, based on an adenovirus 5 in which its fiber was substituted by the respective structure from adenovirus 11, demonstrated increased infectivity in human cells, particularly in
T Lymphocytes by using the CD46 molecule instead of the coxsackievirus and adenovirus receptor (CAR). Both vector systems expressed high levels of Tre-recombinase under the control of an HIV-1 Tat-dependent LTR promoter.
These vector systems had no negative effect on cell viability, apoptosis or cell-cycle distribution in transduced Jurkat T cells. The vector-delivered Tre-recombinase exhibited significant antiviral effects in HIV-1 indicator cell-lines and reporter constructs. Because of a low functional titer of the lentiviral vector system, only the chimeric adenoviral vector system was further analysed in HIV-infected primary T lymphocytes, demonstrating significant antiviral effects. These data demonstrated that the chimeric adenoviral vector system holds great potential for secure and efficient gene transfer into human cells and, in particular, for transient expression of Tre-recombinase. The results obtained here support HIV gene therapies based on autologous T cell transplantation to achieve a functional cure for HIV infection.

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