FAQ
© 2015 Staats- und Universitätsbibliothek
Hamburg, Carl von Ossietzky

Öffnungszeiten heute09.00 bis 24.00 Uhr alle Öffnungszeiten

Eingang zum Volltext in OPUS

Hinweis zum Urheberrecht

Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-70885
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2014/7088/


Aptamervermittelter Wirkstofftransport

Aptamer mediated Drug Delivery

Kruspe, Sven

pdf-Format:
 Dokument 1.pdf (5.818 KB) 


Freie Schlagwörter (Deutsch): Aptamere , RNA-Cross-Linking , Interleukin-6 Rezeptor , Nukleosid-Analoga , Photodynamische Therapie
Freie Schlagwörter (Englisch): Aptamers , RNA-Cross-Linking , Interleukin-6 Receptor , Nucleosid-Analoga , Photodynamic Therapy
Basisklassifikation: 44.40 , 35.16 , 42.15 , 35.75
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Hahn, Ulrich (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 31.10.2014
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 15.12.2014
Kurzfassung auf Deutsch: Aptamere sind einzelsträngige Oligonukleotide (DNA oder RNA), die aufgrund ihrer dreidimensionalen Faltung in der Lage sind, Zielmoleküle mit hoher Affinität und Spezifität zu binden. Sie sind daher mit Antikörpern vergleichbar, weisen jedoch entscheidende Vorteile gegenüber diesen auf, wie die einfachere Herstellung und chemische Modifizierbarkeit sowie ihre geringere Immunogenität. Aptamere, die ein Zelloberflächenprotein binden, z. B. einen Tumormarker, eignen sich für den aktiven Wirkstofftransport eines Therapeutikums durch das Ansteuern bestimmter Zielzellen.
In der vorliegenden Arbeit wurden das 106 nt RNA-Aptamer AIR-3 und seine minimale Verkürzung, das 19 nt G-Quadruplex-bildende AIR-3A, verwendet, um Therapeutika in Zielzellen einzuschleusen. Diese Aptamere binden an den humanen Interleukin-6-Rezeptor (hIL-6R) auf der Zelloberfläche und werden mit ihm durch Endozytose in die Zelle aufgenommen. Interleukin-6 und hIL-6R stehen im Zusammenhang mit der Entstehung und dem Fortschreiten verschiedener chronischer Entzündungen und Autoimmunerkrankungen, wie Rheumatoider Arthritis oder Multipler Sklerose, als auch der Entstehung von Krebs.
Als ein möglicher Wirkstoff für den gerichteten Transport durch die genannten Aptamere wurde der Photosensibilisator Chlorin e6 ausgewählt. Chlorin e6 erzeugt unter Bestrahlung mit langwelligem sichtbaren Licht zytotoxische reaktive Sauerstoffspezies. Chlorin e6 wurde mit AIR 3A über eine Amid-Bindung verknüpft. Es konnte nachgewiesen werden, dass dieses Aptamer-Chlorin e6 Konjugat in zweistelligen nanomolaren Konzentrationen effizient von hIL-6R-positiven BaF3-Zellen aufgenommen wurde. Zellspezifische Toxizität erfolgte durch anschießende LED-Bestrahlung ausschließlich in hIL-6R-positiven Zellen. Die Effizienz des Konjugates übertraf die des freien Chlorine6 um ein bis zwei Größenordnungen unter identischen Versuchsbedingungen.
Ein weiterer verwendeter Wirkstoff war das chemotherapeutisch wirksame Nukleosid-Analogon 5-Fluor-2′-desoxyuridin (5-FUdR). Das Aptamer AIR-3 wurde intrinsisch mit diesem modifiziert, durch Austausch der Uridine gegen 5-FUdR. Diese modifizierte Aptamervariante wies eine um etwa eine Größenordnung geringere Affinität zu hIL-6R auf (Kd = 151 +/- 3 nM) als das unmodifizierte Aptamer (Kd = 20,9 +/- 2,6 nM) und hatte eine spezifischen Proliferationsrückgang um 25% für hIL-6R-positive BaF3-Zellen zur Folge. Zellzyklusanalysen der betroffenen Zellen zeigten, dass dies durch eine S-Phase-spezifische Zytotoxizität bedingt war, die durch externe Zufuhr von 2‘-Desoxythymidin kompensiert werden konnte. Daher wurde auf 5-Fluor-2‘-desoxyuridin-5‘-monophosphat (5 FdUMP) als aktiven Metabolit in den Zielzellen geschlossen, der intrazellulär durch Degradation des Aptamers und anschließende Phosphorylierung des dadurch freigesetzten 5-FUdR entsteht.
Dazu wurden in dieser Arbeit Studien zur Charakterisierung der molekularen Interaktion von AIR-3A und hIL-6R durchgeführt. Hierfür wurden die an der Bindung beteiligten Reste der RNA und des Proteins durch UV-aktivierte Reaktionen kovalente miteinander verknüpft. Durch anschließende Fragmentierungen der RNA einerseits oder des Proteins andererseits konnten Hinweise auf die Lage an der Bindung beteiligter Aminosäurereste und Nukleobasen erhalten werden. Diese Ergebnisse können zukünftige zur detaillierten Beschreibung der Bindung als auch zur Beschreibung von G-Quadruplex-Faltungen allgemein genutzt werden.
Kurzfassung auf Englisch: Aptamers are single stranded oligonucleotides (DNA or RNA) with the ability to bind a certain target molecule due to their unique three-dimensional structure. Thus comparable, aptamers comprise significant advantages over antibodies such as convenient synthesis and feasibility in chemical derivatization as well as non-immunogenicity. Aptamers targeting a cell surface protein, e.g. a tumor marker, can be utilized to convey therapeutic cargo molecules into certain target cells.
In the presented thesis the 106mer RNA-aptamer AIR-3 and its 19mer G quadruplex forming truncation AIR-3A were used for the delivery of therapeutic agents into cells bearing the human interleukin-6 receptor (hIL6R). The aptamers bound to hIL6R are internalized via endocytosis. Interleukin-6 and its receptor are involved in the formation and progression of several inflammatory and autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis and multiple sclerosis, as well as the development of cancer.
The photosensitizer chlorin e6 was chosen as one delivery cargo. Chlorin e6 generates reactive oxygen species upon longwave irradiation. It was conjugated to AIR-3A via an amid-linkage. Substantial uptake of the aptamer-chlorin e6 conjugate could be observed when hIL6R presentig cells were exposed to nanomolar amounts of it. Specific cell death could be induced to these cells by additional irradiation while hIL6R negative cells remained unharmed under the same conditions. To induce the same extend of non-cell specific cell death with the free chlorin e6 micromolar amounts are required.
Another therapeutic agent used for cell specific drug delivery is the chemotherapeutic nucleoside analog 5-Fluoro-2′-deoxyuridine (5-FUdR). The aptamer AIR-3 was intrinsically modified with this drug by replacement of its uridine nucleosides with 5-FUdR. This modified aptamer variant was still able to bind the hIL-6R and could induce S-phase cytotoxicity to hIL-6R presenting cells exclusively. Cell cycle Analysis of the affected cells was performed, implying that this effect is based on the release of 5-FUdR inside the cells by the degradation of the internalized aptamer.
Finally the interface of aptamer AIR-3A and hIL-6R was investigated by covalent linking of the two biomolecules using UV activated cross inking. The subsequent fragmentation of either the RNA-aptamer or its target protein revealed insights into the molecular connectivity of binding complex formed by them. These results may in future be used for a detailed binding model as well as for a better understanding of G quadruplex folding and protein binding in general.

Zugriffsstatistik

keine Statistikdaten vorhanden
Legende