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Hamburg, Carl von Ossietzky

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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-65829
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2015/6582/


Functional analysis of the insulin receptor substrate protein of 53 kDa (IRSp53) in the brain of Mus musculus (Linnaeus 1758)

Funktionelle Analyse des Insulinrezeptorsubstratproteins von 53 kDa (IRSp53) im Gehirn von Mus musculus (Linnaeus 1758)

Bobsin, Kristin

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Freie Schlagwörter (Deutsch): IRSp53 , Postsynaptische Dichte , Langzeit-Potenzierung
Freie Schlagwörter (Englisch): IRSp53 , postsynaptic density , long-term potentiation
Basisklassifikation: 42.15 , 42.13 , 42.84
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Kreienkamp, Hans-Jürgen (PD Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 20.12.2013
Erstellungsjahr: 2013
Publikationsdatum: 02.12.2015
Kurzfassung auf Englisch: The postsynaptic density (PSD) of excitatory synapses in the central nervous system (CNS) is a tightly packed compartment that integrates, processes and transmits input signals. A reor-ganisation of the postsynapse enables the modulation of synaptic efficacy; this phenomenon is known as synaptic plasticity and underlies learning and memory formation. One abundant postsynaptic protein is the insulin receptor substrate protein of 53 kDa (IRSp53). IRSp53 is a powerful regulator of the actin cytoskeleton and therefore a suitable candidate to promote postsynaptic reorganisation. However, in vivo analysis of IRSp53 knock out (ko) mice unveiled no morphological alterations in the CNS. Instead, IRSp53 null-mice displayed severe cognitive impairments in simple learning tasks. A cellular model for synaptic improvement implicated in memory formation is the long-term potentiation (LTP), which is significantly enhanced in the hippocampus of IRSp53 ko mice. How does IRSp53 contribute to synaptic plasticity?
One hypothesis is that a critical amount of IRSp53 is required for the protein to fulfil its func-tion. A suitable approach to test a reduction of IRSp53 in a physiological context was to analyse IRSp53 heterozygous (+/d) mice. Indeed, these mice show a severe cognitive deficit in the contextual fear-conditioning assay, similar to that observed for IRSp53 ko mice. Quantifica-tion of the IRSp53 amounts reveal different IRSp53 accumulation levels in the PSD of different forebrain regions of IRSp53 haploinsufficient mice; as a significantly larger proportion of the protein is located in the hippocampal PSD. Expression studies in primary neurons indicate that the IM- and CRIB domains of IRSp53, as well as the PDZ ligand are important for the synaptic localisation. Live imaging indicates that IRSp53 reaches the postsynapse by diffusion where it is tethered by its postsynaptic interaction partners.
As known from prior experiments the amount of NMDA receptors is increased in the PSD of IRSp53 ko mice; this could be responsible for the enhanced LTP. Analysis of the compositions of PSD with respect to proteins involved in cognition shows a changed distribution of ionotropic glutamate receptors in the cortex, hippocampus and striatum. During the development the NMDA receptor subunit GluN2B is exchanged by the GluN2A subunit. This developmental switch seems to be retarded in the cortex and hippocampus due to the reduction or loss of IRSp53. Although the total number of NMDA receptors remains constant, the number increas-es in the PSD of the hippocampus. However, no change in the NMDA receptor surface expression was detectable. Therefore, a shift of the extrasynaptic GluN2B containing NMDA receptors towards the synapse can be assumed.
Biochemical analysis of the NMDA receptor dependent LTP via chemical stimulation of acute hippocampal slices shows an altered phosphorylation pattern of different signalling mol-ecules. Both the loss and the reduction of IRSp53 results in an increased phosphorylation of the transcription initiation factor CREB. Otherwise, the activation of the kinases ERK1/2 and Akt1 decreases. Both kinases are responsible for boosting the translational capacity of the cell required to stabilise and maintain LTP as well as for memory formation. Thus, IRSp53 seems to affect not only the quantity and composition of postsynaptic NMDA receptors but also the NMDA receptor-mediated signal transduction and gene expression that are essential for memory formation.
Kurzfassung auf Deutsch: Die postsynaptische Dichte (PSD) exzitatorischer Synapsen ist ein dicht gepacktes Netz-werk von Proteinen, welches verantwortlich ist für die Integration, Verarbeitung und Weiterleitung eingehender Signale. Eine Umstrukturierung der Postsynapse ermöglicht eine Anpassung ihrer Effizienz; dies ist bekannt als synaptische Plastizität, welche der Gedächtnis-bildung zugrunde liegt. Ein in der PSD angereichertes Protein ist das Insulin Rezeptor Substrat Protein von 53 kDa (IRSp53). Funktionelle Analysen in auf Zellkulturen basierenden Systemen weisen IRSp53 als einen einflussreichen Regulator des Aktinzytoskeletts aus, der essentiell für die Umstrukturierung der PSD sein könnte. Analysen IRSp53-defizienter Mäuse zeigten jedoch keine morphologischen Veränderungen des neuronalen Netzwerkes. Stattdessen zeigten IRSp53 knock out (ko) Mäuse massive kognitive Beeinträchtigungen in einfachen Verhaltens-tests. Ein zelluläres Modell für die Steigerung der synaptischen Effizienz ist die Langzeitpoten-zierung (LTP), welches signifikant im Hippocampus von IRSp53-defizienten Tieren erhöht ist.
Ziel dieser Arbeit ist die Erforschung des Proteins IRSp53 im zentralen Nervensystem in Be-zug auf dessen Rolle in der synaptischen Plastizität. Für die Analyse eines möglichen Gendosiseffektes wurden IRSp53 heterozygote (+/d) Mäuse mittels Angstkonditionierung un-tersucht. Die Tiere zeigen, wie ihre IRSp53 ko Geschwister, deutliche kognitive Beein-trächtigungen. Die biochemische Quantifizierung der IRSp53 Proteinmenge offenbarte eine unterschiedlich starke Anreicherung von IRSp53 in der PSD verschiedener Gehirnregionen bei IRSp53-haploinsuffizieten Tieren; so ist im Hippocampus der IRSp53 +/d Tiere ein deutlich größerer Anteil des Proteins in der PSD angereichert. Expressionsstudien in kultivierten Pri-märneuronen zeigen eine Beteiligung der IRSp53 IM- und CRIB Domäne sowie des PDZ Liganden an dessen postsynaptischer Akkumulation. Mittels Diffusion scheint IRSp53 an die Postsynapse zu gelangen, wo es durch seine Interaktionspartner verankert wird.
Bereits publizierte Daten demonstrieren eine Erhöhung der NMDA-Rezeptormenge in der PSD, die vermutlich verantwortlich für die Erhöhung der LTP ist. Untersuchungen abundanter Proteine der PSD ergaben eine veränderte Verteilung der ionotropen Glutamatrezeptoren im Cortex, Hippocampus und Striatum IRSp53-haploinsuffizienter und -defizienter Mäuse. Wäh-rend der Entwicklung des ZNS erfolgt ein Austausch von NMDA-Rezeptoren, welche anstelle von GluN2B GluN2A Untereinheiten beinhalten. Im Cortex und Hippocampus von IRSp53 +/d und d/d Tieren scheint dieser Entwicklungsschritt verzögert zu sein. Während die Gesamt-menge konstant bleibt, ist die Anzahl der NMDA Rezeptoren in der PSD des Hippocampus signifikant erhöht. Es konnte keine veränderte Oberflächenexpression der NMDA Rezeptoren im Hippocampus nachgewiesen werden. Dies lässt eine Verschiebung der extrasynaptischen NMDA Rezeptoren hin zur Synapse vermuten.
Untersuchungen des NMDA-Rezeptor-abhängigen LTPs mittels chemischer Stimulation akuter hippocampaler Schnitte zeigten ein verändertes Phosphorylierungsmuster verschiede-ner Signalmoleküle. Sowohl der Verlust als auch die Reduktion von IRSp53 verursacht eine erhöhte Aktivierung des Transkriptionsinitiationsfaktors CREB. Andererseits sinkt die Aktivie-rung der Kinasen ERK1/2 und Akt1. Diese steigern die Kapazität der Zelle zur Proteinsynthese, welche benötigt wird für die Stabilisierung und Konsolidierung des LTPs so-wie für die Gedächtnisbildung. Demzufolge scheint IRSp53 nicht nur die Menge und Zusam-mensetzung der postsynaptischen NMDA-Rezeptoren zu beeinflussen, sondern auch die NMDA-Rezeptor vermittelte Signaltransduktion und Genexpression, die für die Gedächtnisbildung essentiell sind.

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