Die systematische Durchführung der Multicolor-Durchflusszytometrie zur T-Zell-Phänotypisierung mit kritischer Betrachtung der Anwendungsmöglichkeiten und Grenzen

Abstract

Die funktionelle Beurteilung von T-Zellen ist ein wichtiges, aber bisher nur unbefriedigend gelöstes diagnostisches Problem im Umgang mit Patienten mit eingeschränkter Immunantwort. Die Entwicklung der Multicolor-Durchflusszytometrie bietet neue Möglichkeiten, T-Zell Antworten zu charakterisieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Multicolor-Durchflusszytometrie in der Arbeitsgruppe etabliert und anhand praktischer Versuche deren Anwendungsmöglichkeiten untersucht. Dabei wurde ein systematisches Konzept für die Entwicklung von Färbepanels entwickelt, mit dessen Hilfe zwei Panels (Zytokin-Panel und Memory-Panel erstellt wurden. Schließlich wurden die Anwendungsmöglichkeiten und Grenzen des Ansatzes untersucht. Um zu gewährleisten, dass auch seltene Events zuverlässig detektiert werden können, mussten die Bedingungen des Assays optimiert werden. Als Stimulus war SEB am besten geeignet. Die Inkubationszeit sollte mindestens 5 Stunden betragen. Als optimale Stimulationsdauer zeigten sich 8.5h mit Zugabe eines Golgi-Blockers nach 2h. Die Dichte der Zellen sollte 6*106/ml nicht überschreiten, um eine optimale Antwort nicht zu schwächen. Es ist wichtig, einen Vitalfarbstoff zu verwenden, insbesondere um seltene Events zu messen. Für die intrazelluläre Anfärbung hat sich der amine reactive dye nearIR ViD als geeignet erwiesen.

Für die Auswahl eines Korrelates der Aktivierung spielen die Kinetik, Sensitivität, Spezifität und Handhabung eine Rolle. Unter den hier etablierten Bedingungen waren CD154 für CD4 T-Zellen und CD137 für CD8 T-Zellen am besten geeignet. Für das Panel-Design ist eine sorgfältige Zuordnung der Antikörper zu den Farbstoffkanälen des Geräts wichtig. Sie erfolgte nach rationalen Kriterien wie Spillover, Fluorochrom-Intensität und Ausstattung des verwendeten Durchflusszytometers. Daraus ergab sich ein Basispanel zur Bestimmung der Haupt-Zellpopulationen, das nach den Anforderungen des aktuellen Experimentes mit Aktivierungsmarkern ergänzt werden konnte: CD56 PE-Cy7, CD4 PerCP-Cy5.5, CD3 PacificBlue und nearIR ViD. Die Kanäle für FITC, PE und Alexa647 blieben für Anpassungen frei. Die Kompensation der Messungen nimmt eine wichtige Stellung in der Multicolor-Durchflusszytometrie ein. Um eine korrekte Kompensation zu gewährleisten, wurde jeder Antikörper nach einem systematischen Ansatz titriert. Um den Einfluss der Autofluoreszenz von Zellen auf die Kompensationseinstellungen auszuschalten, wurde die Kompensation mit an Beads gebundenen Antikörpern durchgeführt. Als Kontrolle zur Bestimmung der Positivität von Aktivierungsmarkern wurde das Prinzip der fluorescence minus one Kontrolle eingesetzt.

Die in der vorliegenden Arbeit entwickelten Panels wurden exemplarisch angewendet, um ihre Möglichkeiten und Grenzen zu untersuchen. Mit dem Zytokin-Panel konnte die Qualität von T-Zell-Antworten bestimmt werden und Einfach- bis Dreifach-Zytokinproduzenten unterschieden werden. Im T-Zell-Pool eines Normalkollektivs ergab sich eine Aufteilung 7% (triple), 24% (double) und 69% (single) unter den CD4 Zellen und 1% (triple), 28% (double) und 71% (single) unter den CD8-Zellen. Das Normalkollektiv kann als Bezugsrahmen für weitere Messungen verwendet werden. Die Qualität der Antwort spielt eine zentrale Rolle bei der Impfstoffentwicklung. Die zunehmende Menge an verfügbaren Markern macht einen Konsensus in der Definition von T-Zell-Populationen nötig. Mit dem Memory-Panel wurden die Reifungsstadien von T-Zellen betrachtet. Dabei zeigte sich im Normalkollektiv gesunder Blutspender bei CD4-Zellen eine andere Verteilung als bei CD8-Zellen. Es ist zu definieren welche Abweichungen Krankheitswert haben könnten. In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Gentherapie des Instituts für Biochemie wurde die T-Zell-Antwort auf eine Tumorvakzine charakterisiert. In der Zytokinbestimmung nach 24h Inkubation zeigten sich deutliche Unterschiede hinsichtlich des Effektes, den die Transfektion unterschiedlicher Zytokine in Tumorzellen auf die Stimulation einer allogenen T-Zell-Antwort erzielten.

In the evaluation of immunocompromised patients the functional assessment of T cells is an important but not yet sufficiently solved diagnostic problem. Multicolor flow cytometry offers new possibilities in the characterization of T cell responses. In the present work multicolor flow cytometry was established in the workgroup and its applications were evaluated by using practical experiments. A systematic approach for designing antibody panels was developed, resulting in two panels (cytokine panel and memory panel). Eventually potential applications and limits of this approach were studied. To reliably detect even rare events the stimulation assay had to be optimized. SEB was the most suitable stimulating agent. Assays should be incubated for at least 5 hours. The optimal duration of stimulation was determined at 8.5 h with addition of a Golgi block after 2 h. The cell density should not exceed 6*106/mL to not weaken an optimal response. To detect rare events it is crucial to use a viability dye. For intracellular staining the amine reactive dye nearIR ViD was suitable.

For the selection of an activation marker the kinetics, sensitivity, specificity and handling have to be considered. With the assay conditions outlined above the most suitable activation markers were CD154 for CD4 T cells and CD137 for CD8 T cells. When designing a panel a careful pairing of fluorophores to fluorescence channels of the flow cytometer has to be ensured. This was done by rational criteria like spilllover, fluorochrome intensity and equipping of the flow cytometer in use. The result is a basic panel to characterize the main cell populations with the option to expand further activation markers: CD56 PE-Cy7, CD4 PerCP-Cy5.5, CD3 PacificBlue and nearIR ViD. We spared the channels for FITC, PE and Alexa647 for adaptations. Compensation is of utmost importance in multicolor flow cytometry. In order to minimize spillover, each antibody was titrated by a systematic approach. To eliminate the influence of cell autofluorescence to the compensation settings, the compensation was carried out using antibodies bound to beads. As a control to determine the cut off for activation markers, the principle of fluorescence minus one was used.

The panels developed in the present work were applied exemplarily to study their applications and limitations. The cytokine panel can be used to determine the quality of T cell responses and to distinguish single, double and triple cytokine producers. In a group of healthy subjects there were 7% triple, 24% double and 69% single cytokine producers within the CD4 cells and 1% triple, 28% double and 69% single producers in the CD8 cells. This group can be used as a norm group for further experiments. The quality of the T cell response plays a pivotal role in vaccine development. The constantly growing number of available markers demands a consensus in the definition of T cell populations. The memory panel was used to measure stages of T cell maturation. In the norm group distribution within the stages differed in CD4 and CD8 cells. It has yet to be defined which deviations have clinical significance. In collaboration with the gene therapy working group from the Department of Biochemistry the T cell response to a tumor vaccine was characterized. In these experiments the cytokine panel showed significant differences in the effect achieved by the transfection of different cytokines into tumor cells to stimulate the allogeneic T cell response after 24h of incubation.