In Vitro and In Vivo Studies of Efficacy of Nilotinib on Plexiform Neurofibromas

Abstract

Plexiforme Neurofibrome (PNF) sind benigne Tumore peripherer Nerven und meist mit Neurofibromatose Typ 1 assoziiert. Sie erstrecken sich häufig über mehrere Gewebeschichten, so dass eine vollständige chirurgische Resektion erschwert wird. Nilotinib ist ein Tyrosinkinaseinhibitor, welcher Anwendung in der Leukämie-Therapie findet und gegenüber dem Prototypen Imatinib potenter, aber auch selektiver gegen BCR-ABL, DDR, PDGFR und KIT- Rezeptorkinasen gerichtet ist. Die Wirksamkeit von Nilotinib und Imatinib wurde in vitro an PNF-Primär kulturen, bestehend aus Schwann-Zellen und Fibroblasten getestet, wobei die Zellproliferation, Vitalität, Viabilität, Apoptose und Kollagenaseaktivität gemessen wurde. Für in vivo Experimente wurden PNF-Tumorstücke am Nervus ischiadicus athymischer Nacktmäuse implantiert und anschließend mit Nilotinib bzw. Imatinib behandelt. Die xenotransplantierten Tumore wurden wöchentlich mittels eines Kleintierultraschallgeräts dargestellt und Größenveränderungen des Tumorvolumens berechnet sowie der maximale Plasmaspiegel von Nilotinib drei Stunden nach der letzten oralen Applikation mittels Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie bestimmt. Die Aktivität natürlicher Killerzellen konnte durch Zytotoxizitätsmessungen nicht-adhärenter muriner Milzzellen als Effektorzellen gegen Schwann-Zellen aus PNFs, als Target, in einem Verhältnis von 1:10 gemessen werden. Die Nilotinib-Behandlung führte in vitro zu einer verringerten Zellproliferation, Vitalität und Viabilität mit einer 50%igen inhibitorischen Konzentration (IC50) zwischen 2,3 und 11,9 µM. Für fünf der acht untersuchten PNFs war der IC50, im Vergleich zu Fibroblastenzellen in Schwann-Zell-Primärkulturen geringer, was auf eine Selektivität gegen Schwann-Zellen, als beschriebene Tumorzellen in PNFs, hindeutet. Nilotinib induzierte zudem Apoptose und supprimierte die Kollagenaseaktivität. In vivo führte die tägliche Gabe von 100 mg/kg Nilotinib über vier Wochen zu einer Tumorreduktion von 68±7% und war somit signifikant stärker als in der unbehandelten Gruppe mit 33±8% (P<0.05) sowie der Imatinib-Gruppe mit 47±15% (P<0.05). Der maximale Plasmaspiegel von Nilotinib lag bei 6.6±1.1 μM und somit im pharmakologischen Bereich klinischer Applikation. Imatinib erhöhte zudem signifikant die Zytotoxizität muriner Milzzellen auf Schwann-Zellen aus PNFs im Vergleich zur Kontrollgruppe (21.1±7.2% vs. 12.5±7.1%). Die Ergebnisse deuten darauf hin, das Nilotinib potenter ist als Imatinib und somit für die Behandlung von plexiformen Neurofibromen als potentielles Medikament weiter untersucht werden sollte.

Plexiform neurofibromas (PNFs) are benign tumors from peripheral nerves and mostly associated with neurofibromatosis type 1. They often extend through multiple layers of tissue and therefore cannot be treated satisfactorily by surgery. Nilotinib is a tyrosine kinase inhibitor used to treat leukemia, with advantages over the prototype imatinib in terms of potency and selectivity towards BCR-ABL, DDR, PDGFR, and KIT receptor kinases. The efficacies of nilotinib and imatinib on the primary cultures containing Schwann cells and fibroblasts derived from PNFs were tested in vitro, by means of monitoring cell proliferation, vitality, viability, apoptosis and collagenase activity. For in vivo experiment, fragments of PNFs were xenografted onto sciatic nerve of athymic nude mice and these mice were treated with nilotinib and imatinib, respectively. Xenografts were monitored weekly using a high resolution ultrasound measurement and size-change was followed by calculating their volumes. Peak plasma nilotinib concentration was measured 3 h after the last oral administration using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Activation of natural killer cells were examined by measured cytotoxicity of non-adherent mouse spleen cells of the mice as effector cells to PNF-derived Schwann cells as target cells at a ratio of 1:10. Nilotinib treatment led to decreased proliferation, vitality and viability of all cells with 50% inhibitory concentration (IC50) varying from 2.3 to 11.9 μM. For five out of the eight PNFs studied, IC50 was lower in Schwann cells than in fibroblasts for all parameters measured, suggesting good drug-selectivity for Schwann cells which are the tumor cells in PNFs. In addition, nilotinib induced apoptosis and suppressed collagenase activity. In vivo, nilotinib-treatment at a daily dose of 100 mg/kg for four weeks led to a reduction of the graft volumestd by 68±7%, significantly more than the 33±8% reduction in the untreated mice (P＜0.05) and the 47±15% in the mice treated with imatinib (P<0.05). The peak plasma nilotinib concentration 6.6±1.1 μM is within the pharmacological range of clinical application. Imatinib significantly elevated cytotoxicity of mouse spleen cells on PNF-derived Schwann cells when compared with the control group (21.1±7.2% vs. 12.5±7.1%). The results suggest that nilotinib is more potent than imatinib for treating PNFs and therefore should be further explored as a potential drug for some PNFs.