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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-71435
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2015/7143/


Functional Analyses of Anti-B-Cell Antibodies Used to Treat Lymphoma

Funktionelle Analyse von Anti-B Zell Antikörpern zur Lymphombehandlung

Wu, Huei-Shan

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SWD-Schlagwörter: Aggressive B-cell lymphoma
Freie Schlagwörter (Deutsch): Aggressive B-cell lymphoma , functional analyses
Freie Schlagwörter (Englisch): Aggressive B-cell lymphoma , functional analyses
Basisklassifikation: 35.70
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Spillner, Edzard (Assoc. Prof.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 19.12.2014
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 22.01.2015
Kurzfassung auf Englisch: Rituximab, a chimeric IgG1К anti-CD20 monoclonal antibody, was first to be approved for treatment of B-cell lymphoma in 1998 after clinical studies had shown dramatic improvement in outcome of virtually all B-cell lymphoma patients when Rituximab was combined with chemotherapy. Notwithstanding the enormous success of Rituximab in treating patients with B-cell lymphoma, a substantial number of patients show no or suboptimal responses to rituximab or become refractory after initial treatment. Therefore, the search for new potentially more potent antibodies targeting malignant B cells continues.

The aim of this work was to develop general strategies how anti-B-cell antibodies can be evaluated most effectively and how the efficacy of different and new anti-B-cell antibodies (namely obinutuzumab, ofatumumab and BI 836826) can be compared with rituximab in vitro. Using healthy donor and patient NK cells isolated from peripheral blood as effector cells and various cell lines mimicking the most frequent lymphoma subtypes as target cells different functional assays based on the mechanisms of action of anti-B-cell antibodies were established: the CD 107a degranulation assay and the Europium release assay for antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC), PI staining cell death assay for complement-dependent cytotoxicity (CDC), and the Annexin V / PI staining assay for programmed cell death (PCD). We also looked at immune synapse formation (ISF) and homotypic aggregation (HA) as early events when effector cells target tumor cells.

We show that performing one assay for ADCC and one assay for CDC with healthy donor cells as effector cells and cell lines SU-DHL-4 and OCY-Ly 10 as target cells give representative results allowing to gain reliable insight into the potency of old and new anti-B-cell antibodies. The use of patient effector cells as well as more cell lines or patient lymphoma cells as target cells can be restricted to antibodies which show promising results in the assays mentioned above. Immune synapse formation and homotypic aggregation showed substantial differences when various antibodies were investigated. Because no comparative results using these methodologies so far exist, elucidating the role of these assays will need further experimentation.

Obinutuzumab, a third generation type II anti-CD 20 antibody, and BI 836826, a new Fc-engineered anti-CD 37 antibody, showed significantly stronger ADCC and PCD than established antibodies. The type I antibodies ofatumumab and rituximab performed better in CDC. BI 836826 showed moderate results in CDC and induced strong cytoskeleton polarization in ISF compared with other antibodies. The promising in vitro results with obinutuzumab were recently confirmed in clinical studies and led to licensing of this antibody for treatment of lymphoma. BI 836826 is another promising candidate anti-B-cell antibody which is being investigated in phase I clinical studies.

Comparative in vitro testing of anti-B-cell antibodies can be effectively done using a limited array of functional tests. These assays will allow to predict which antibodies can be considered promising candidates to enter the much more laborious and expensive sequence of clinical studies.
Kurzfassung auf Deutsch: Rituximab, ein chimärer monoklonaler IgG1К anti-CD 20 Antikörper, wurde bereits 1998 als erster Antikörper weltweit für die Behandlung maligner B-Zell Lymphome zugelassen, nachdem klinische Studien eine dramatische Verbesserung des Überlebens praktisch aller mit Rituximab (und Chemotherapie) behandelter Patienten mit B-Zell Lymphomen ergeben hatten. Trotz der enormen Behandlungserfolge mit Rituximab spricht ein nicht unbedeutender Prozentsatz von Patienten mit B-Zell Lymphomen nicht oder nur unzureichend auf die Behandlung an oder wird im Laufe der Therapie refraktär. Aus diesem Grund geht die Suche nach neuen, potentiell besseren Antikörpern weiter.

Ziel dieser Arbeit war es, allgemeine Strategien zu entwickeln wie anti-B-Zell Antikörper möglichst effektiv untersucht werden können und wie verschiedene neue anti-B-Zell Antikörper (Obinutuzumab, Ofatumumab und BI 836826) in vitro mit Rituximab verglichen werden können. NK-Zellen von gesunden Spendern oder Patienten wurden als Effektorzellen, Zelllinien oder frisch gewonnene Lymphomzellen von Patienten als Zielzellen für verschiedene Assays untersucht, die die wesentlichen Wirkungsmechanismen von anti-B-Zell Antikörpern reflektieren: der CD 107a Degranulierungs-Assay und der Europium Assay um die Antikörper-vermittelte Zytotoxizität (ADCC) zu messen, der PI staining cell death Assay um die Komplement-vermittelte Zytotoxizität und der Annexin V / PI staining Assay um den programmierten Zelltod zu untersuchen. Außerdem wurde die Ausbildung der Immunsynapse und die homotypische Aggregation als frühe Ereignisse einer zellulär vermittelten Immunantwort untersucht.

Wir zeigen, dass ein ADCC Assay und ein CDC Assay unter Verwendung von gesunden Spenderzellen als Effektorzellen und zweier Zelllinien (SU-DHL-4 und OCI-Ly 10) als Zielzellen ausreichen, um einen verläßlichen Einblick in das Potenzial verschiedener anti-B-Zell Antikörper zu bekommen. Der Einsatz von Effektorzellen, die vom Patienten stammen, kann ebenso wie die Verwendung weiterer Zelllinien oder gar von Patientenlymphomzellen als Zielzellen auf die Fälle beschränkt bleiben, in denen die ersten Tests erfolgversprechend waren. Die Ausbildung von immunologischen Synapsen und die homotypische Aggregation zeigten sehr unterschiedliche Ergebnisse, je nachdem welcher Antikörper verwendet wurde. Da bisher keinerlei vergleichende Untersuchungen vorliegen, bleibt abzuwarten, welche Bedeutung diesen Beobachtungen beizumessen ist.

Obinutuzumab, ein Typ II Antikörper der dritten Generation, und BI 836826, ein neuer anti-CD 37 Antikörper, dessen Fc Teil zur Steigerung der Effektivität genetisch manipuliert wurde, zeigten gegenüber etablierten CD20 Antikörpern eine erheblich gesteigerte Wirksamkeit in den Tests, die ADCC und PCD messen. Die älteren Typ I Antikörper Ofatumumab und – in geringerem Ausmaß –, auch Rituximab, zeigten eine effektivere Komplement-vermittelte Zytotoxizität. BI 836826 zeigte im Vergleich zu anderen Antikörpern eine mäßige Komplement-vermittelte Zytotoxizität und eine starke Polarisation der Zellgerüststrukturen (cytoskeleton). Die vielversprechenden in vitro Ergebnisse mit Obinutuzumab fanden kürzlich ihre Bestätigung in entsprechenden klinischen Studien, die zur Zulassung von Obinutuzumab zur Therapie bestimmter Lymphome geführt haben. BI 836826 ist ein neuartiger anti-CD 37 Antikörper, dessen frühe klinische Prüfung (Phase I) aufgrund der positiven in vitro Tests derzeit läuft.

Die vergleichende experimentelle Untersuchung verschiedener anti-B-Zell Antikörper mit Hilfe weniger gut ausgewählter Standard Assays ist möglich. Diese in vitro Untersuchungen erlauben eine zuverlässige Vorhersage, welche der getesteten Antikörper erfolgversprechend erscheinen, sodass eine wesentlich komplexere und teurere klinische Prüfung gerechtfertigt erscheint.

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