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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-71534
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2015/7153/


Development of a cell-based intraocular deliverysystem for neurotrophic factors to attenuate retinalganglion cell loss in a mouse model of glaucoma

Entwicklung eines Stammzell-basierten intraokulären Applikationssystems neurotropher Faktoren zur Verminderung des Verlustes retinaler Ganglienzellen in einem Mausmodell des Glaukoms

Flachsbarth, Kai

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SWD-Schlagwörter: Ciliary neurotrophic factor , Brain-derived neurotrophic factor , Neurotropher Faktor , Stammzelle , Glaukom , Augenheilkunde
Freie Schlagwörter (Deutsch): Grüner Star , retinale Ganglienzellen , Degeneration
Freie Schlagwörter (Englisch): glaucoma , retinal ganglion cells , degeneration , neurotrophic factors , neural stemm cells
Basisklassifikation: 44.95 , 42.20 , 42.13
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Bartsch, Udo (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 16.01.2015
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 26.01.2015
Kurzfassung auf Englisch: Loss of vison as a result of glaucomatous optic neuropathies is the second leading cause for blindness in industrialized countries. Glaucomatous optic neuropathies are characterized by a progressive degeneration of retinal ganglion cell (RGCs) bodies in the retina and their axons in the optic nerve, ultimately resulting in a disruption of signal transduction from the eye to the brain. The progressive loss of retinal ganglion cells results in localized visual field defects, and eventually in complete blindness. Clinically, the major risk factor for glaucoma is elevated intraocular pressure (IOP), and lowering IOP is currently the only proven treatment for glaucoma. However, the diseases progresses in a significant proportion of patients despite successful lowering of IOP. Furthermore, glaucoma may develop in patients despite a normal IOP. Thus, there is a need for alternative treatments of this neurodegenerative disorder of the inner retina. The aim of the present thesis was to establish a neural stem cell-based delivery system that allows a continuous and long-lasting intraocular supply of neurotrophic factors, with the ultimate aim to attenuate the loss of RGCs in a mouse model of glaucoma.
In the present thesis, adherently cultivated neural stem (NS) cells from the cerebral cortex of embryonic mice were used as cellular vectors to administer neurotrophic factors to the murine retina. NS cells maintained under adherent culture conditions comprise a homeogenous population of clonogenic, symmetrically dividing tripotent stem cells. We then used polycistronic lentiviral vectors to stably co-express different neurotrophic factors together with a fluorescent reporter protein and a resistance gene in NS cells. To establish and evaluate this cell-based neuroprotective approach, we expressed three different neurotrophic factors with a known neuroprotective activity on RGCs, ciliary neurotrophic factor (CNTF), glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in NS cells. We then took advantage from the fact that expression levels of the neurotrophic factors and the fluorescent reporter proteins from the polycistronic lentiviral vectors are proportional to each other, and selected single cells with high expression levels of the reporter gene using fluorescent activated cell sorting. Subsequent clonal expansion of these cells resulted in clonal NS cell lines with high expression levels of CNTF, GDNF or BDNF.
To analyze the neuroprotective potential of the modified NS cell lines in vivo, degeneration of RGCs was induced in adult mice by an intraorbital crush of the optic nerve and cells were intravitreally grafted one day after the lesion. All three clonal cell lines attached to the posterior pole of the lenses and the vitreal surface of the retinas, preferentially differentiated into astrocytes and survived for up to four months in the host eyes. Furthermore, the donor cells stably expressed the neurotrophic factors and fluorescent reporter proteins. Adverse effects of the donor cells on the morphology of the host retinas were not observed. Importantly, all three NS cell lines significantly attenuated the lesion-induced degeneration of RGCs over a time period of at least two (for the GDNF- and BDNF-expressing cell line) or four months (for the CNTF-expressing cell line; longer post-lesion intervals were not analyzed). The CNTF-expressing NS cell line additionally stimulated long distance regeneration of the lesioned RGC axons. Of note, neuroprotection of axotomized RGCs was markedly enhanced after transplantation of a mixture of the GDNF- and CNTF-expressing cell line when compared to transplantations of each individual clonal cell lines. Quantitative analyses of these data revealed a significant synergistic neuroprotective activity of GDNF and CNTF on axotomized RGCs.
Together, data of the present thesis indicate that genetically modified NS cell lines may serve as valuable tools to evaluate the therapeutic potential of a sustained cell-based intraocular administration of neurotrophic factors in animal models of glaucoma. Clonal NS cell lines with a forced expression of neurotrophic factors may also be a useful tool for combinatorial neuroprotective approaches aimed at identifying combinations of neurotrophic factors with additive or synergistic neuroprotective effects on RGCs.
Kurzfassung auf Deutsch: Das Glaukom ist die zweithäufigste Ursache für Blindheit in industrialisierten Ländern. Charakteristisch für glaukomatöse Optikusatrophie ist die progressive Degeneration der Zelkörper retinaler Ganglienzellen (RGC) in der Retina und ihrer Axone im optischen Nerven, was zu einer Unterbrechung der Signaltransduktion zwischen Auge und Gehirn führt. Der fortschreitende Verlust der RGC resultiert in lokalen Gesichtsfeld-Einschränkungen, welche schließlich zu vollständiger Blindheit führen. Der, aus klinischer Sicht, wichtigste Risikofaktor für eine Glaukomerkrankung ist ein erhöhter Augeninnendruck und eine Reduktion des Augeninnendrucks ist die zurzeit einzig bekannte Therapieoption. In einem signifikanten Teil der Patienten schreitet die Krankheit jedoch trotz einer erfolgreichen Senkung des Augeninnendrucks weiter fort, während andere Patienten auch ohne erhöhten Augeninnendruck an einem Glaukom erkranken. Es ist also notwendig für diese neurodegenerative Erkrankung der inneren Retina alternative Therapiemethoden zu entwickeln. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Etablierung eines auf neuralen Stammzellen (NSC) basierenden Applikationssystems, welches eine kontinuierliche und dauerhafte Versorgung mit neurotrophen Faktoren ermöglicht, mit dem Ziel dem Verlust von RGC in einem Glaukom-Mausmodell entgegen zu wirken. In der vorliegenden Arbeit wurden adhärent kultivierte NSC aus dem zerebralen Kortex von Mausembryonen als zelluläre Vektoren genutzt um neurotrophe Faktoren der murinen Retina zuzuführen. NSC die unter adhärenten Kulturbedingungen gehalten wurden, bildeten eine homogene Population aus klonogenen, tripotenten Stammzellen, welche sich symmetrisch teilen. Diese NSC wurden dann mit einem polycistronischen lentiviralen Vektor transduziert um eine stabile Ko-Expression verschiedener neurotropher Faktoren zusammen mit fluoreszierenden Reporter-Proteinen in diesen Zellen zu erreichen. Um dieses Zell-basierte System zu etablieren und zu untersuchen wurden drei verschiedene neurotrophe Faktoren verwendet, welche bereits bekannt waren für ihre neuroprotektive Aktivität im Zusammenhang mit RGC, um diese in unseren NSC zu exprimieren. Diese drei Faktoren waren der „ciliary neurotrophic factor“ (CNTF), der „glial cell line-derived neurotrophic factor“ (GDNF) und der „brain-derived neurotrophic factor“ (BDNF). Da die Expressionsstärke der neurotrophen Faktoren und der fluoreszierenden Reporterproteine proportional zueinander stehen, konnten anschließend Zellen mit hoher Expression des Reportergens durch „fluorescent activated cell sorting“ (FACS) ausgewählt und vereinzelt werden. Diese Einzelzellen wurden dann genutzt um durch klonale Expansion klonale NSC-Linien mit hoher Expression von CNTF, GDNF und BDNF zu produzieren. Um das neuroprotektive Potential der modifizierten NSC in vivo zu analysieren, wurde die Degeneration von RGC in adulten Mäusen durch eine Quetschung des optischen Nervens induziert und die Zellen einen Tag nach der Läsion intravitreal transplantiert. Alle drei klonalen Zell-Linien adhärierten an der posterioren Seite der Linse oder an der vitrealen Seite der Retina, wo sie präferentiell in Astrozyten differenzierten und bis zu vier Monate überlebten. Weiterhin zeigten die transplantierten Zellen eine stabile Expression der neurotrophen Faktoren und der Reporterproteine über die gesamte Versuchsdauer hinweg. Negative Effekte der transplantierten Zellen auf die Morphologie der Empfängerretinas wurden nicht beobachtet. Alle drei Zell-Linien waren in der Lage die induzierte Degeneration von RGC über einen Zeitraum von zwei (im Fall der GDNF- und BDNF-Linie) oder vier Monaten (im Falle der CNTF-Linie; längere Versuchszeiträume wurde nicht untersucht) signifikant zu reduzieren. Die CNTF-exprimierende NSC-Linie stimulierte überdies eine weitreichende Regeneration der lädierten Axone. Die Neuroprotektion axotomierter RGC erhöhte sich merklich nach der Transplantation einer Mischung der GDNF- und CNTF-Linie im Vergleich zu Transplantationen der einzelnen klonalen Zell-Linien. Die quantitative Analyse dieser Daten zeigte eine signifikante synergistische neuroprotektive Aktivität von GDNF und CNTF auf axotomierte RGC. Zusammengefasst deuten die Daten der vorliegenden Arbeit darauf hin, dass genetisch modifizierte NSC-Linien als hilfreiches Werkzeug fungieren können um das therapeutische Potential einer dauerhaften Zell-basierten intraokulären Applikation von neurotrophen Faktoren in Glaukom-Tiermodellen zu untersuchen. Klonale NSC-Linien mit einer Überexpression neurotropher Faktoren könnte weiterhin nützlich sein um Kombinationen von neurotrophen Faktoren zu identifizieren, welche additive oder synergistische neuroprotektive Effecte auf RGC zeigen.

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