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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-71823
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2015/7182/


Funktion des Transkriptionsfaktors Runx1 in der frühen B-Zellentwicklung in Mus musculus (Linnaeus, 1758)

Kriebitzsch, Neele-Margarete

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SWD-Schlagwörter: Hämatopoese
Freie Schlagwörter (Deutsch): Runx1 , B-Zellentwicklung
Basisklassifikation: 42.99
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Stocking, Carol (PhD)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 13.02.2015
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 03.03.2015
Kurzfassung auf Deutsch: Die frühe B-Zellentwicklung ist durch eine geordnete Umlagerung der Gen Loci gekennzeichnet, die für die schwere und die leichte Kette des B-Zellrezeptors (BZRs) kodieren. Die erfolgreiche Rekombination dieser Immunglobulin-Loci wird hierbei an verschiedenen Kontrollpunkten überprüft. So wird die Rekombination der schweren Kette des BZRs analysiert, indem diese zusammen mit der Ersatz-leichten-Kette als Prä-B-Zellrezeptor (Prä-BZR) auf der Zelloberfläche der frühen Prä-B-Zellen transient exprimiert wird. Durch die Signaltransduktion des Prä-BZRs wird an diesem wichtigen Kontrollpunkt die Proliferation, aber auch die weitere Differenzierung der Vorläuferzellen reguliert. Dysregulationen in den Prä-BZR-abhängigen Signalwegen können zur malignen Transformation der B-Zellprogenitoren beitragen und die Entstehung Prä-B-zellspezifischer akuter lymphoider Leukämien (Prä-B-ALLs) begünstigen. Besonders häufig ist die Translokation t(12;21), die zur Expression des ETV6-RUNX1 Fusionsproteins führt, in Prä-B-ALLs zu finden. Für das Fusionsprotein wird eine dominant-negative Inhibierung der RUNX1 Zielgene postuliert. Runx1 gehört zu den zentralen Transkriptionsfaktoren der Hämatopoese. Interessanterweise zeigen konditionale knockout Mausmodelle bei Verlust der Runx1-Funktion einen Block in der frühen B-Zelldifferenzierung, sodass die Aktivität von Runx1 für die Entwicklung dieser Vorläuferzellen unerlässlich zu sein scheint. Dennoch ist bisher nicht viel über die genaue Funktion von Runx1 und Runx1 regulierte Zielgene in der frühen B-Zellentwicklung und insbesondere am Prä-BZR Kontrollpunkt bekannt.
Ziel dieser Arbeit war es daher, ein besseres Verständnis über die Runx1-abhängige transkriptionelle Regulation in den frühen B-Vorläuferzellen zu erhalten. In der hier vorliegenden Arbeit konnte mithilfe eines konditionalen Runx1 knockout Mausmodells der Block in der B-Zelldifferenzierung stromabwärts des Prä-BZR-Kontrollpunkts beim Übergang in späte Prä-B-Zellen detektiert werden. Weiterhin wurden zwei Gruppen von Runx1-Zielgenen gefunden, für die bereits Funktionen innerhalb der Prä-B-Zellpopulationen diskutiert werden. Diese beiden Gruppen umfassen (1) Mitglieder der Lyn-Src-Kinase-Familie wie Hck und Blk sowie (2) die Transkriptionsfaktoren Aiolos und Spi-B. Durch eine genomweite Analyse der Runx1-DNA-Bindungsstellen konnte die direkte Bindung vor allem an Enhancer-Elemente der identifizierten Runx1-Zielgene festgestellt werden.
Die Aktivierung zelltypspezifischer Zielgene ist für die Differenzierung von Vorläuferzellen essentiell und wird durch komplexe transkriptionelle Netzwerke reguliert. Durch die Analyse der Prä-BZR-abhängigen Aktivierung von Runx1-Zielgenen und durch die Untersuchung der Phosphorylierungslevel von Runx1 vor und nach der Prä-BZR-Signalgebung konnten in der hier vorliegenden Arbeit mehrere Runx1-regulierte transkriptionelle Netzwerke identifiziert werden. Diese beinhalten unter anderem die sogenannten „Feedforward“ Motive und fördern daher die Differenzierung der frühen Prä-B-Zellen nach Aktivierung des Prä-BZRs. Es konnte gezeigt werden, dass Runx1 in einem ersten Netzwerk zunächst die Expression der Lyn-Src-Kinasen induziert. Nach Stimulation des Prä-BZRs phosphorylieren diese anschließend bestimmte Tyrosinreste im Runx1 Protein, wodurch die transkriptionelle Aktivität von Runx1 spezifisch verstärkt wird. In der Folge kann Runx1 die Expression differenzierungsfördernder Zielgene wie Ikzf3 und Spib aktivieren. Aufgrund der in dieser Arbeit identifizierten Ko-Lokalisation der DNA-Bindungsmotive von Runx1 und Spi-B wurde zudem postuliert, dass Runx1 in einem weiteren regulatorischem Netzwerk zunächst zusammen mit B-zellspezifischen Transkriptionsfaktoren wie E2A und Pax5 die Expression von Spib induziert. Im Anschluss wiederum interagieren Runx1 und Spi-B und regulieren gemeinsam weitere Prä B zellspezifische Zielgene, die die Differenzierung in unreife B Zellen vorantreiben.
Zusammengefasst konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass Runx1 am Prä-BZR-Kontrollpunkt die Aufgabe eines zentralen Regulators in verschiedenen transkriptionellen Netzwerken übernimmt. Die Aktivität von Runx1 am Prä-BZR-Kontrollpunkt ist somit für die weitere Differenzierung der Vorläuferzellen essentiell. Bei Verlust der Runx1-Funktion in ETV6-RUNX1 exprimierenden Zellen können diese transkriptionellen Netzwerke nicht mehr aufrechterhalten werden. In der Folge können differenzierungsfördernde Gene wie IKZF3 und SPIB stromabwärts der Prä-BZR-Signalgebung nicht mehr aktiviert werden, sodass die Balance zwischen Proliferation und Differenzierung am Prä-BZR-Kontrollpunkt nicht mehr gewährleistet ist und die Zellen in einen prä leukämischen Zustand versetzt werden.
Kurzfassung auf Englisch: Early B-cell development is characterized by stepwise rearrangements of the immunoglobulin gene loci which are important for the diversified heavy and light chains that form the antigen-specific B-cell receptor (BCR). Productive rearrangements are controlled at different checkpoints during B-cell differentiation. During the first checkpoint a pre-BCR, which is composed of the rearranged heavy chain and a surrogate light chain, is transiently expressed on the cell surface of early pre-B-cells. Signaling of the pre-BCR is responsible for proliferation and subsequent differentiation of these progenitor cells. Disruption of this checkpoint contributes to malignant transformation and to the development of a pre-B-cell acute lymphoblastic leukemia (pre-B-ALL). A common recurrent event in pre-B-ALL is the chromosomal translocation t(12;21), leading to the expression of the ETV6-RUNX1 fusion protein. It has been postulated that the fusion protein inhibits normal RUNX1 target genes. Runx1 is one of the key transcription factors during hematopoiesis and is involved in many processes that control myeloid and lymphoid development. Importantly, conditional Runx1 knockout mice exhibit a defect in differentiation of early B-cell progenitors. However, little is known about the function of Runx1 and its target genes in the early B-cell populations, especially during the pre-BCR checkpoint.
Therefore, the goal of this study was to better understand the Runx1-dependent transcriptional regulation in early B-cell progenitors. In this work, the block in B-cell differentiation in Runx1-deficient mice was localized downstream of the pre-BCR checkpoint at the transition to the late pre-B-cell stage. Furthermore, two groups of Runx1-target genes could be identified, which have previously been implicated in signaling pathways downstream of the IL-7-receptor and the pre-BCR in early pre-B-cells and therefore likely contribute to the observed B-cell block in Runx1-deficient mice. These include genes which encode (1) members of the Lyn-Src kinase family e.g. Hck and Blk and (2) the transcription factors Aiolos and Spi-B. Genome-wide analysis of Runx1-DNA-binding sites confirmed direct binding to the identified target genes, which was characterized by a preferential binding to distal enhancer elements. Moreover, for the Aiolos-encoding Ikzf3 locus it could be shown that DNA looping between the Runx1-bound enhancer element and a proximal sequence of the promoter element occurred. This reveals one possible mechanism how binding of Runx1 to defined enhancer elements can directly influence the specific expression of Runx1-target genes.
The activation of cell type-specific target genes is essential for the differentiation of progenitor cells and regulated by complex transcriptional networks. By analyzing the consequences of pre-BCR signaling on Runx1-target gene activation and on Runx1 phosphorylation, several Runx1-regulated transcriptional networks were identified in this study. These are composed of “feedforward” motifs and therefore likely support the differentiation of pre-B-cell progenitors downstream of pre-BCR signaling. In the first feedforward loop, Runx1 induces the expression of Lyn-Src-kinases. These kinases, in turn, reinforce Runx1 phosphorylation after activation of pre-BCR signaling, leading to an enhanced transcriptional activity of Runx1. Consequently, Runx1 can activate the expression of specific downstream target genes that promote further differentiation (e.g. Spib and Ikzf3). Based on the co-localization of Runx1 and Spi-B DNA binding motifs that were identified during this work, a second feedforward loop was postulated. In this regulatory network, Runx1 induces the expression of Spib in cooperation with B-cell specific transcription factors such as E2A and Pax5. After activation of Spib, Runx1 and Spi-B jointly regulate further pre-B-cell specific downstream targets driving differentiation to the immature B-cell stage.
In summary, this work has revealed that Runx1 is a lynchpin in transcriptional networks that govern the pre-BCR checkpoint and is essential for further differentiation of early pre-B-cells. Loss of Runx1 function in ETV6-RUNX1 expressing cells leads to disruption of these transcriptional networks. As a consequence, differentiation promoting genes like IKZF3 and SPIB are not activated downstream of pre-BCR signaling. Therefore, the balance between differentiation and proliferation at the pre-BCR checkpoint is no longer ensured, leading to the development of a pre-leukemic phenotype. These new insights into Runx1-dependent transcriptional regulation at the pre-BCR checkpoint may help to define relevant pharmaceutical targets for reversing the disruptive action of the ETV6-RUNX1 fusion protein.

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