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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-71850
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2015/7185/


Identifizierung antigener Determinanten der E-Proteine von Dengue-Viren zum Nachweis Dengue- sowie Serotyp-spezifischer Antikörper

Identification of antigenic determinants of E proteins of dengue viruses for the detection of dengue- and serotype-specific antibodies

Franzke, Kati

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Basisklassifikation: 42.32
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Hahn, Ulrich (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 06.02.2015
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 12.03.2015
Kurzfassung auf Deutsch: In dieser Arbeit wurden Domänen und Teilstrukturen der Oberflächenproteine der vier Serotypen des Dengue-Virus (DENV), PrM und E, als MBP-Fusionsproteine in E. coli exprimiert und aus E. coli-Lysat gereinigt. Ein vorab selektiertes Set von Antigenen wurde in einem Immunoblot-Test mit 988 DENV-positiven Seren aus Kambodscha untersucht, um Antigene für einen neuen serologischen DENV-Test zu identifizieren.
Vom PrM-Protein wurden drei MBP-Fusionsproteine hergestellt, die jedoch in der Reaktion mit DENV-positiven Seren negativ waren. Damit waren die untersuchten PrM-Antigene weder für den Nachweis von Serotyp-spezifischen noch von gruppenreaktiven Antikörpern geeignet.
Für die E-Proteine der vier Dengue-Viren wurden insgesamt 51 MBP-Fusionsproteine hergestellt, die Teile oder die kompletten Domänen ED1, ED2 und ED3 repräsentieren.
Sowohl für ED1 als auch für ED2 zeigten die Teilsequenzen ED1.2, ED1.3 und ED2.1 keine Reaktionen mit DENV-positiven Seren. Die Konstruktion der vollständigen ED1- und ED2-Domänen erfolgte durch die Verknüpfung der entsprechenden Domänen-Abschnitte mit der Aminosäuresequenz Glycin-Prolin-Glycin (ED1.1-GPG-ED1.2-GPG-ED1.3; ED2.1-GPG-ED2.2). Die GPG-verknüpfte ED1- und ED2-Domäne von DENV-2 zeigten dabei Reaktionen in unterschiedlicher Intensität mit mindestens 90 % der 988 in Kambodscha getesteten Patientenseren und stellen damit potentielle Kandidaten für einen allgemeinen DENV-Test dar.
Die serologische Charakterisierung der ED3-spezifischen Antigene zeigte, dass alle linearen Teilsequenzen im Test negativ waren. Nur die vollständigen ED3-Domänen oder die ED3-Domänen mit Teilen der Stem-Region (ED3S) zeigten positive Reaktionen. Zum Nachweis gruppenspezifischer DENV-Antikörper waren daher nur die vollständigen ED1, ED2 und ED3-Domänen geeignet.
Zum Nachweis Serotyp-spezifischer Antikörper wurden die ED3-Antigene mit einer Kombination aus SDS und DTT bei 100°C modifiziert. Das modifizierte ED3-Antigen (ED3*) zeigte in einer ersten Studie bei 40,6 % der 988 DENV-positiven Seren eine Serotyp-spezifische Reaktion. Durch Optimierung der Modifizierung konnte das ED3* Antigen hinsichtlich der Erkennung des DENV-Serotyps verbessert werden. Zur weiteren Optimierung wurde am Beispiel des DENV-3 eine Antigen-Bibliothek erstellt und getestet, welche die Herstellung vieler verschiedener DENV-3 ED3-Sequenzen ermöglicht und damit verschiedene Genotyp-Varianten des DENV-3 Serotyps repräsentiert.
Mit dem Antigen-Set aus modifizierten ED3*, ED3S und nativem ED3 konnte für 58 % der 988 Patientenseren aus Kambodscha ein DENV-Serotyp bestimmt werden, während mit der nativen ED3-Domäne allein nur für 8,3 % eine Zuordnung des Serotyps möglich war. Somit stellen ED3* und ED3S potentielle Kandidaten für einen Serotyp-spezifischen DENV-Test dar.
Kurzfassung auf Englisch: In this study, domains and sub-structures of the PrM and E surface proteins of all dengue virus (DENV) serotypes, were expressed as MBP fusion proteins in E. coli and purified from E. coli lysate. A pre-selected set of antigens was examined by immunoblot using 988 patient sera from Cambodia in an attempt to identify antigens for a new serological test for DENV.
Of the PrM protein three MBP fusion proteins were produced that showed only negative reactions with patient sera. Therefore the MBP fusion proteins of PrM were not suitable for the detection of serotype-specific or group-reactive antibodies.
Of the E proteins of the four DENV serotypes a total of 51 MBP fusion proteins were expressed and purified representing the entire domains ED1, ED2 and ED3 or parts thereof.
Partial sequences of either ED1 or ED2 (ED1.2, ED1.3, ED2.1) did not react with DENV-positive sera. The complete ED1 and ED2 domains were created by linking the corresponding partial sequences with the amino acid sequence glycine-proline-glycine (ED1.1-GPG-ED1.2-GPG-ED1.3; ED2.1-GPG-ED2.2). These GPG-linked domains showed positive reactions with patient sera, especially the ED1 and ED2 domains of DENV-2. They react to varying degrees with at least 90 % of the 988 patient sera from Cambodia, making them candidates for a serological DENV test.
The serological characterizations of the ED3-specific antigens resulted in negative reactions for all the partial sequences of ED3. Only the full ED3 domains or the ED3 domains with parts of the stem region (ED3S) showed positive reactions with patient sera. This suggests that only the full ED1, ED2 and ED3 domains were able to detect group-reactive antibodies.
For the detection of serotype-specific antibodies, the ED3 domains were modified with a combination of SDS and DTT and incubation at 100 °C. The modified ED3 antigens (ED3*) showed serotype-specific reactions with 40.6 % of the 988 patient sera. The optimization of the modification conditions resulted in improved serotype-specific reactions.
To further optimize the serotype-specific reactions an antigen library was created and screened on the example of DENV-3, allowing the production of many different DENV-3 ED3 sequences and the representation of various genotypes of the DENV-3 serotype.
With the selected set of antigens consisting of modified ED3*, ED3S and native ED3 the DENV serotype could be determined for 58 % of the 988 patient sera from Cambodia while using only native ED3 assignment of the serotype was possible for 8.3 %. This make ED3* and ED3S potential candidates for serotype-specific DENV-test.

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