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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-71913
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2015/7191/


Vergleich von Nanobodies und konventionellen Antikörpern für die molekulare in vivo Bildgebung von T-Zellen

In vivo near-infrared fluorescence targeting of T cells : comparison of nanobodies and conventional monoclonal antibodies

Well, Lennart

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SWD-Schlagwörter: Antikörper , Bildgebendes Verfahren , Lymphozyt
Freie Schlagwörter (Deutsch): Nanobody , Nah-Infrarot-Bildgebung , T Lymphozyten , Theranostics
Freie Schlagwörter (Englisch): nanobody , antibody , near-infrared fluorescence imaging , theranostics , T cells
Basisklassifikation: 44.64 , 44.45 , 44.51
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Koch-Nolte, Friedrich (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 17.02.2015
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 12.03.2015
Kurzfassung auf Deutsch: Die ADP-Ribosyltransferase 2 (ART2) ist ein auf murinen T Lymphozyten exprimiertes, toxinverwandtes Ekto-Enzym. Unter Verwendung seines Substrates Nicotinamidadenindinukleotid (NAD) kann es Zelloberflächenproteine mit ADP-Riboseresten modifizieren. Effekte dieser ADP-Ribosylierung sind der Abwurf (Shedding) von Oberflächenproteinen und der NAD induzierte Zelltod (NICD). Um eine bessere Beurteilbarkeit der von ART2 ausgelösten Effekte zu gewährleisten, wurden von unserer Arbeitsgrupppe ART2 defiziente (ART2 KO) und ART2 überexprimierende, transgene (ART2 TG) Mauslinien etabliert.
In dieser Dissertation wurden die Pharmakokinetik, Biodistribution, sowie die inhibierenden und bildgebenden Eigenschaften von drei gegen ART2 gerichteten Antikörperformaten in der Nah-Infrarot-Fluoreszenzoptischen Bildgebung (NIRF) analysiert. Hierbei sollte festgestellt werden, welches der verwendeten Konstrukte sowohl dem Anspruch eines diagnostischen Werkzeugs für die in vivo Bildgebung, wie auch der Enzyminhibition in vivo genügt. In der Literatur hat sich hierfür der Begriff des Theranostic etabliert.
Bei den verwendeten Antikörperformaten handelt es sich um einen sogenannten Nanobody (s+16a, 17 kDa), ein Nanobody-Fc-Fusionsprotein (s+16mFc, 82 kDa), sowie einen monoklonalen Antikörper (Nika102, 150 kDa). Nanobodies sind Fragmente von Schwere-Ketten-Antikörpern, welche zusätzlich zu konventionellen
Antikörperklassen von Kameliden exprimiert werden.
Alle drei untersuchten Antikörperformate zeigten eine spezifische Bindung an ART2, aber nur die Schwere-Ketten-Antikörper basierten Konstrukte waren in der Lage, ART2 zu inhibieren. In vivo zeigte der Nanobody eine schnelle, aber kurz anhaltende Inhibition von ART2, während das Nanobody-Fc-Fusionsprotein eine anhaltende Inhibition aufwies. Der monoklonale Antikörper zeigte eine dem Nanobody-Fc-Fusionsprotein ähnelnde Kinetik, ohne Inhibition von ART2. In den bildgebenden Versuchen in vivo war mit allen Konstrukten eine Detektion der murinen Lymphozyten in ART2 TG Mäusen innerhalb der axillären und inguinalen Lymphknoten möglich. Hierbei zeigten sich den vorherigen Versuchen entsprechende Kinetiken. Diese Ergebnisse konnten nach anschließender Präparation der Organe und Bestimmung der jeweiligen Signalstärken bestätigt werden.
Am Beispiel der ART2 zeigt diese Arbeit, dass die NIRF Bildgebung und zeitgleiche Modifikation einer Enzymaktivität im Sinne eines Theranostic mittels Nanobodies möglich ist.
Kurzfassung auf Englisch: ADP-Ribosyltransferase 2 (ART2) is a toxin-related ecto-enzyme, which is expressed on murine T cells. It is able to ADP-ribosylate proteins by utilizing its substrate nicotinamide adenine dinucleotide (NAD). Effects of ADP-Ribosylation include shedding of cell-surface proteins and
the NAD induced cell death (NICD). To better investigate these effects, ART2 knockout (ART2 KO) and ART2 overexpressing, transgenic (ART2 TG) mice were generated by our group.
In this work, the pharmacokinetics, biodistribution and imaging properties of three ART2 targeting antibody-constructs were compared and their imaging capabilities were determined, using near-infrared-fluorescence-imaging (NIRF). The objective of these experiments was to determine, which of the applied constructs is best suited for simultaneous enzyme inhibition and NIRF imaging in vivo. The established term for such a probe is theranostic.
The different types of ART2 specific antibody constructs used in the experiments are a nanobody (s+16a, 17 kDa), a nanobody-Fc-fusion-protein (s+16mFc, 82 kDa) and a monoclonal antibody (Nika102, 150 kDa).
Nanobodies are fragments of heavy-chain-antibodies which are expressed by Camelidae in addition to conventional antibodies. These fragments maintain the antibodies ability to bind their respective targets and are able to inhibit enzymes by blockade of their active centre.
All three antibody constructs bound specifically to ART2, whereas only the constructs based on heavy-chain-antibodies were able to inhibit ART2 activity. In vivo experiments showed a short lasting but potent inhibition of ART2 by the nanobody and a slowly increasing level of ART2 inhibition by the nanobody-Fc-fusion-protein after injection. The monoclonal antibody displayed similar kinetics as the nanobody-Fc-fusion-protein without inhibition of ART2. In NIRF imaging
experiments in vivo, all antibody constructs enabled the detection of axillary and inguinal lymph nodes in ART2 TG mice. The determined kinetics were similar to those found by the previously performed experiments. The in vivo imaging results were confirmed by dissection and ex vivo imaging of single organs.
This work shows in a proof of principle study that NIRF imaging and simultaneous enzymeinhibition is feasible. It indicates that single-domain nanobodies are best suited for short-term uses, whereas larger nanobody-Fc-fusion proteins are better suited for long-term uses.

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