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URN: urn:nbn:de:gbv:18-72114
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2015/7211/


Funktionelle Charakterisierung von humanen CBL- und RRAS-Proteinvarianten für ein besseres Verständnis der Pathophysiologie bei RASopathien

Functional characterization of human CBL- and RRAS-protein variants for a better understanding of the pathophysiology of RASopathies

Brand, Kristina

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SWD-Schlagwörter: Noonan-Syndrom , Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor , Integrine
Freie Schlagwörter (Deutsch): RASopathien , CBL , RRAS , EGFR Transport
Freie Schlagwörter (Englisch): Noonan syndrome , RASopathies , EGFR trafficking , CBL , RRAS
Basisklassifikation: 42.13 , 42.20
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Kutsche, Kerstin (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 06.02.2015
Erstellungsjahr: 2014
Publikationsdatum: 24.03.2015
Kurzfassung auf Deutsch: RASopathien umfassen eine Gruppe von klinisch überlappenden Erkrankungen, die durch Keimbahnmutationen in für Proteine des RAS-MAPK-Signalwegs kodierenden Genen verursacht werden. Das Noonan-Syndrom ist das am häufigsten vorkommende Syndrom unter den RASopathien und ist durch typische kraniofaziale Dysmorphien, Kleinwuchs und kongenitale Herzfehler gekennzeichnet. Ein Drittel der Betroffenen zeigt zudem Lernschwierigkeiten.
Vor wenigen Jahren wurde das Tumorsupressorgen CBL als Krankheitsgen für einen mit dem Noonan-Syndrom ähnlichen Phänotyp identifiziert. CBL kodiert für ein multivalentes Adapterprotein mit E3-Ubiquitin-Ligase-Aktivität, das über Ubiquitylierung eine Vesikel-basierte Internalisierung und Degradierung des epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) Rezeptors (EGFR) initiiert und so den zellulären EGFR-Transport (trafficking) reguliert.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden die funktionellen Auswirkungen der RASopathie-assoziierten CBL-Aminosäuresubstitutionen p.K382E, p.D390Y und p.R420Q auf Liganden-induzierte/s EGFR-Ubiquitylierung und EGFR-trafficking untersucht. Mittels Koimmunpräzipitationen wurde gezeigt, dass eine Expression von CBLK382E, CBLD390Y und CBLR420Q in EGF-stimulierten COS7-Zellen zu einer verminderten EGFR-Ubiquitylierung führt; darüber hinaus war die Degradierung des EGFR verzögert. Des Weiteren konnte mit Hilfe von Zelloberflächenbiotinylierungs-Experimenten in den CBL-Mutanten exprimierenden Zellen eine erhöhte Menge an EGFR an der Zelloberfläche und eine signifikante Reduktion der intrazellulären EGFR-Menge nachgewiesen werden. Beide Ergebnisse weisen auf eine ineffektive EGFR-Internalisierung hin. Damit übereinstimmend war in diesen Zellen auch die Rezeptor-vermittelte Aufnahme von EGF vermindert, was immunzytochemisch mit fluoreszenz-markiertem EGF488 festgestellt wurde.
Diese Daten zeigen, dass die pathogenen CBL-Mutationen den Vesikel-basierten Transport vom EGFR stark verändern. Eine dem Noonan-Syndrom und anderen RASopathien gemeine pathophysiologische Auffälligkeit ist die Hyperstimulation der RAS-MAPK-Signalkaskade; dementsprechend konnte in CBLK382E-, CBLD390Y- oder CBLR420Q-exprimierenden Zellen eine erhöhte Phosphorylierung der MAP-Kinase ERK detektiert werden. Zusammengefasst kann das durch CBL-Mutationen veränderte EGFR-trafficking als Ursache für die Hyperstimulation der RAS-MAPK-Signalkaskade postuliert und somit erstmals ein verändertes EGFR-trafficking als zugrunde liegender Pathomechanismus für eine RASopathie beschrieben werden.

Kürzlich wurde berichtet, dass Mutationen im RRAS-Gen ebenfalls zu einem Noonan-Syndrom überlappenden Phänotyp führen. Das kleine GTP-bindende Protein RRAS übernimmt in der Zelle als molekularer Schalter eine zentrale Funktion bei der Signalweiterleitung, indem es zwischen einem aktiven, GTP-gebundenen und einem inaktiven, GDP-gebundenen Zustand alterniert. RRAS-abhängige Signalwege aktivieren Integrine und regulieren die Komposition bzw. Dynamik von fokalen Adhäsionen, was einem klassischen inside-out Signalweg entspricht; RRAS seinerseits kann wiederum nach Integrin-Liganden Bindung im Sinne eines outside-in Signalwegs gesteuert werden. Allerdings sind die molekularen Mechanismen innerhalb beider Signalrichtungen noch völlig unklar. Aus diesem Grund wurden im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit die molekularen Zusammenhänge zwischen RRAS und den Integrinen untersucht. Zuerst wurde mittels GTPase-Pull-Down Experimenten in stabil RRASWT-exprimierenden CHO-Zellen verifiziert, dass RRAS durch Stimulation der Integrine mit Liganden aktiviert wird, was auf eine Integrin-vermittelte RRAS-Aktivierung im Sinne eines outside-in-signaling schließen lässt. Mehrere Hinweise aus der Literatur ließen vermuten, dass Talin als Brückenprotein bei der RRAS-vermittelten Integrin-Aktivierung eine Rolle spielen könnte. Mittels Koimmunpräzipitationen in COS7-Zellen konnte tatsächlich eine schwache Interaktion zwischen aktivem, GTP-gebundenem RRAS und Talin festgestellt werden; ob diese Bindung direkt oder indirekt stattfindet ist noch nicht abschließend geklärt. Darüber hinaus wurde der GTPase-Effektor RIAM, der zudem ein bekannter Protein-Bindepartner von Talin ist, wiederum mittels Koimmun-präzipitationen als neuer Interaktionspartner von RRAS identifiziert; diese Interaktion stellte sich unabhängig vom RRAS-Aktivitätszustand dar. Zusammengenommen geben die hier erzielten Ergebnisse erste Hinweise auf die molekularen Mechanismen bei der Talin-vermittelten Aktivierung von Integrinen durch RRAS und können so zukünftig zu einem besseren Verständnis der Pathophysiologie bei RASopathien beitragen.
Kurzfassung auf Englisch: RASopathies encompass a group of genetic syndromes caused by mutations in genes coding for proteins which are involved in the RAS-MAPK signaling pathway. Noonan syndrome is the most common disorder among the RASopathies and is characterized by a typical face, short stature and various heart defects. One third of the patients have learning difficulties.
Recently, mutations in the CBL tumor suppressor gene have been reported in patients with a Noonan syndrome-like phenotype. CBL encodes a multivalent adaptor protein with ubiquitin ligase activity, which promotes vesicle-mediated internalization and degradation of the epidermal growth factor (EGF) receptor (EGFR) via ubiquitylation, thereby CBL is a major regulator of cellular EGFR trafficking.
In the first part of this work, the functional consequences of RASopathy-associated CBL amino acid changes p.K382E, p.D390Y and p.R420Q on ligand-induced EGFR ubiquitylation and EGFR trafficking were investigated. Co-immunoprecipitations revealed that the expression of CBLK382E, CBLD390Y or CBLR420Q in COS7-cells resulted in an impaired CBL-mediated EGFR ubiquitylation; consistently, the degradation of EGFR was delayed. Furthermore, by using biotinylation-assays increased levels of surface EGFR and reduced amounts of intracellular EGFR were observed in cells expressing CBL mutants. Both consequences indicate ineffective EGFR internalization. Accordingly, receptor-mediated uptake of EGF was decreased as it was shown by using microscopic analysis with fluorescently labeled EGF (EGF488).
These data indicate that pathogenic CBL mutations severely affect vesicle-based EGFR trafficking. The common trait of Noonan syndrome and other RASopathies is an enhanced signal flow through RAS-MAPK cascade; in line with this, enhanced ERK phosphorylation was detected in cells expressing CBLK382E, CBLD390Y or CBLR420Q. In conclusion, RASopathy-associated CBL mutations cause aberrant EGFR trafficking, which finally results in hyperstimulation of RAS-MAPK pathway. Thus, these data suggest that EGFR trafficking is a novel disease-relevant regulatory level in the RASopathy network.
Recently it has been reported that mutations in the RRAS gene also cause a Noonan syndrome-like phenotype. The small GTP-binding protein RRAS functions as a molecular switch that controls intracellular signaling networks by alternating between an active, GTP-bound and an inactive, GDP-bound state. Within a classical inside-out-signaling pathway RRAS activates integrins and regulates the composition and dynamics of focal adhesions. On the other hand in the direction of an outside-in-signaling cascade RRAS is regulated upon binding of integrins and their respective ligands. Until today the molecular mechanisms within this bidirectional signal flow are poorly understood. Therefore, in the second part of this work the molecular relationships between RRAS an integrins were studied. First, GTPase-pull-down-assays and stably RRASWT expressing CHO-cells were used to verify that that integrin stimulation by extracellular ligands results in RRAS activation; this underscores the presence of an outside-in-signaling pathway involving integrins and RRAS. The integrin binding protein Talin has been suggested to mediate RRAS-dependent integrin activation. Indeed, co-immunoprecipitation experiments in COS7-showed a weak interaction between active, GTP-bound RRAS and Talin; however, if this binding is direct or indirect remains to be determined. Most interestingly, another Talin binding protein, the GTPase effector RIAM, was identified as a new interaction partner of RRAS and notably, the RIAM::RRAS interaction was independent from RRAS activation state. Taken together, these data provide first clues on molecular mechanisms during Talin-mediated activation of integrins by RRAS and may contribute to a better understanding of the pathophysiology of RASopathies in the future.

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